[发明专利]一种同时检测GA I和II型尿液异常代谢化合物的方法

说明书

本发明公开了一种对尿液进行前处理的方法以及基于该方法同时检测GA I和II型尿液异常代谢化合物的方法。所述对尿液进行前处理的方法如下：在尿液中加入尿素酶，然后进行孵育；将尿素酶处理后的尿液样本，加入内标十七烷酸及无水乙醇，充分混匀，离心，取上清液，用氮气吹干，残余物中加入BSTFA和TMCS，进行三甲基硅烷化衍生化处理。然后对处理后的尿液用GC‑MS分析。利用代谢状况无异常的儿童尿液代谢物检测结果作为基准，通过各特征代谢化合物检测值与基准值的比较进行GA I和II型诊断。运用该方法，无需标准品和先验者样本，只要仪器设备满足要求，利用患者的尿液或干尿滤纸片均能准确实现GA的诊断及分型鉴别。

技术领域

本发明涉及一种同时检测GA I和II型尿液异常代谢化合物的方法。

背景技术

戊二酸尿症又称为戊二酸血症(Glutaric aciduria,GA)属于遗传代谢病(inherited metabolic diseases,IMDs)/先天性代谢异常(inborn errors ofmetabolism,IEMs)的范畴，因血液或尿液中出现以戊二酸(glutarate，GA)为代表的系列异常代谢物而得名，又分为戊二酸尿症I型和II型。两种类型的戊二酸尿症有着不同的遗传致病因素和临床表现。戊二酸尿症Ⅰ型(GA I)，是由位于19p13的GCDH基因突变引起戊二酰辅酶A脱氢酶活性完全或部分缺失，造成赖氨酸、羟赖氨酸和色氨酸代谢障碍以致组织和体液中戊二酸(glutarate,GA)、3-羟基戊二酸(3-hydroxyglutarate,3HG)、戊烯二酸(glutaconate)等蓄积的氨基酸类代谢异常。异常代谢物累积尤其在中枢神经系统(脑)内浓度最高，由兴奋性损伤、能量代谢受损和氧化应激等机制导致神经毒性。患者常于出生后3至36个月时因非特异性疾病(发热、感冒、饥饿等)诱发急性脑病危象，致严重神经功能后遗症或死亡。戊二酸尿症II型(GA II)也称多种酰基辅酶A脱氢酶缺陷(MADD)，由编码细胞线粒体的电子转运黄素蛋白(ETF)α/β亚单位或电子转运黄素蛋白脱氢酶(ETFDH)的基因(ETFA、ETFB、ETFDH)先天缺陷，导致多种脂肪酸、支链氨基酸等代谢障碍，伴随体液(血/尿)中大量戊二酸(GA)、乙基丙二酸(EMA)、异戊酰甘氨酸(IVG)、双羧酸等蓄积，是一种干扰机体分解蛋白质和脂肪产生能量的疾病，属于脂肪酸类代谢异常。GAII临床表现复杂多样，从出生后数小时到成年人均可发病。新生儿起病型可伴有先天发育畸形，如多囊肾、肾髓质发育不良、肺脏发育不全、先天性摇椅形平足和面部畸形；表现为出生后数日即出现呼吸困难、代谢性酸中毒、低血糖、高血氨、肌张力低下以及特殊的汗脚气味，病情危重，多于早期死亡。迟发型个体差异大，间歇性发作，多于感染、腹泻、饥饿和药物等应激状态下起病，以心肌、骨骼肌和肝脏受累为主，伴或不伴低血糖、代谢性酸中毒和高氨血症。GA I和II型均属于罕见的常染色体隐性遗传疾病，临床症状非特异，个体差异明显；特别是晚发型患者起病隐匿，诊断比较困难。明确诊断需应用气相色谱-质谱(GC-MS)和串联质谱(MS/MS)分析技术对尿有机酸，血脂肪酸、酰基肉碱成分及含量进行检测。

我国的遗传代谢病质谱筛查起步较晚，基础薄弱。虽然近年来已有多个中心城市的实验室开展基于串联质谱(MS/MS)的血筛查和基于GC-MS的尿筛查工作，但仍存在仪器设备、疾病分析软件依赖进口，缺乏符合中国人种群特异性的IMD诊断标准等不足。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明的一个目的是提供一种对尿液进行前处理的方法。使得处理后的尿液通过GC-MS分析能同时对尿液中的疾病标志物戊二酸(GA)、乙基丙二酸(EMA)、3羟基戊二酸(3HG)、2羟基戊二酸(2HG)、己二酸(adipate)、辛二酸(suberate)、癸二酸(sebacate)以及内源性肌酐(Cr)进行定性和定量分析。

本发明所提供的对尿液样本进行前处理的方法，包括下述步骤：

(1)尿素酶预处理：在尿液样本中加入尿素酶，然后进行孵育；