[发明专利]一种基因治疗安全评估与毒副作用预防的方法

权利要求书

1.一种基因治疗安全评估的方法，其特征在于，包括：

步骤一：提取携带整合型基因治疗载体的靶细胞的基因组，酶切获得DNA片段并在两端连接加上Splinkerette接头寡核苷酸，多聚酶链式反应扩增整合型载体插入位点旁基因组序列，随后通过巢式PCR进一步扩增插入位点旁的基因组序列并在引物中加入接头序列；

步骤二：高通量测序获得整合型载体随机插入位点旁的基因组序列信息，定位整合型基因治疗载体在靶细胞中的插入位点，判断有无插入位点位于原癌基因附近并激活原癌基因的可能。

2.如权利要求1所述的基因治疗安全评估的方法，其特征在于：

步骤一中，酶切使用Sau3AI酶。

3.如权利要求1所述的基因治疗安全评估的方法，其特征在于：

步骤一中，通过巢式PCR进一步扩增插入位点旁的基因组序列并在引物中加入illumina接头序列。

4.一种规避基因治疗毒副作用的预防方法，其特征在于，包括：

步骤一：将iCaspase9基因与治疗基因串联在同一DNA分子内并通过2A肽连接，装入整合型基因治疗载体内，从而使得转录得到的单一信使RNA可以同时过表达iCaspase9基因与治疗基因，

步骤二：在相关安全风险存在时为规避毒副作用，加入AP1903药物激活自杀基因，清除癌变的靶细胞。

5.如权利要求4所述的规避基因治疗毒副作用的预防方法，其特征在于：

步骤一中，包括步骤1-1：使用引物EcoiCasF，序列见SEQ ID No：1和2AiCasR，序列见SEQ ID No：2，以pMSCV-F-del Casp9.IRES.GFP质粒为模板，PCR扩增可诱导性自杀基因iCaspase9编码基因；使用引物2AlucF，序列见SEQ ID No：12和EcolucR，序列见SEQ ID No：13，以pGL3-Basic质粒为模板，PCR扩增荧光素酶Luc编码基因；使用引物EcoiCasF序列见SEQ ID No：1，和EcolucR序列见SEQ ID No：13，以iCaspase9和luciferase片段为模板，重叠延伸PCR扩增获得iCaspase-2A-Luc编码基因；然后，酶切装入pCAG-EGFP质粒的两个EcoRI位点间。

6.如权利要求5所述的规避基因治疗毒副作用的预防方法，其特征在于：

步骤一中，还包括步骤1-2：鸡β-肌动蛋白复合启动子CAG、iCaspase-2A-luc编码序列和兔β-球蛋白polyA由SalI和HindIII酶切，末端补平后，装入缺陷piggyBac转座子中的PmeI位点内。