[发明专利]一种基因治疗安全评估与毒副作用预防的方法

说明书

本发明提供一种基因治疗安全评估与毒副作用预防的方法，本发明在评估整合型载体介导基因治疗安全性时所采取的技术方案是利用Splinkerette‑PCR和illumina高通量测序定位整合型基因治疗载体在靶细胞中的插入位点从而判断有无原癌基因被激活。本发明能够评估基因治疗的安全性，另一方面提供了一种利用预设的可诱导性自杀基因清除癌变靶细胞的技术在相关安全风险存在时用于规避毒副作用。

技术领域

本发明涉及一种基因治疗安全评估与毒副作用预防的方法，属于基因检测领域。

背景技术

基因治疗是从DNA水平治疗人类疾病的治疗手段，具体地是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过特定的基因治疗载体转移导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。

根据是否介导治疗基因整合入人体靶细胞基因组，基因治疗载体可分为整合型载体和非整合型载体。其中，整合型载体具体包括：逆转录病毒、慢病毒、PhiC31整合酶，Sleeping Beauty和piggyBac转座子。现有的整合型基因治疗载体大多介导治疗基因随机插入基因组，故存在诱导随机插入突变、引发细胞癌变的风险。从2002年开始，法国巴黎的研究人员陆续地报告了患者在运用逆转录病毒载体治疗重症联合免疫缺陷(SCID)后患上白血病样疾病的病例。当逆转录病毒载体不恰当地插入了基因组中与淋巴细胞增殖相关的原癌基因附近时，会激活原癌基因，导致淋巴细胞异常扩增(Hacein-Bey-Abina等，2003，Science 302：415-419；Hacein-Bey-Abina等，2008，J.Clin.Invest.118：3132-3142)。其他整合型基因治疗载体也同样存在插入突变诱导癌变的安全风险(Cavazzana-Calvo等，2010，Nature 467：318-322)。

迄今为止，在基因治疗领域仍缺乏一种可用于系统地评估整合型载体安全性并规避潜在风险毒副作用的方法。

发明内容

为了有效地评估整合型载体基因治疗的安全性并预防潜在毒副作用，本发明提供了一种利用高通量插入突变定位技术评估整合型载体介导基因治疗安全性，以及在相关安全风险存在时利用预设的可诱导性自杀基因规避毒副作用的方法。

本发明采用了如下技术方案：

本发明在评估整合型载体介导基因治疗安全性时所采取的技术方案是利用Splinkerette-PCR和illumina高通量测序定位整合型基因治疗载体在靶细胞中的插入位点从而判断有无原癌基因被激活，具体的步骤是：

1)提取携带整合型基因治疗载体的靶细胞的基因组，酶切获得DNA片段并在两端连接加上Splinkerette接头寡核苷酸，多聚酶链式反应(PCR)扩增整合型载体插入位点旁基因组序列，随后通过巢式PCR进一步扩增插入位点旁的基因组序列并在引物中加入illumina接头序列。

2)illumina高通量测序获得整合型载体随机插入位点旁的基因组序列信息，定位整合型基因治疗载体在靶细胞中的插入位点，判断有无插入位点位于原癌基因附近并激活原癌基因的可能。

本发明在相关安全风险存在时规避毒副作用所采取的技术方案是利用预设的可诱导型自杀基因iCaspase9清除癌变的靶细胞，具体的步骤是：

1)将iCaspase9基因与治疗基因串联在同一DNA分子内并通过2A肽连接，装入整合型基因治疗载体内，从而使得转录得到的单一信使RNA可以同时过表达iCaspase9基因与治疗基因。

2)在相关安全风险存在时为规避毒副作用，体内注射AP1903药物激活自杀基因，清除癌变的靶细胞。

进一步，本发明的规避基因治疗毒副作用的预防方法：