[发明专利]一种蛋白包涵体及重组人β-神经生长因子的制备方法

权利要求书

1.一种重组人β-神经生长因子的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤(1)对含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体进行色谱复性，得到复性前体蛋白；

步骤(2)对所述复性前体蛋白进行肠激酶酶切，得到酶解产物；

步骤(3)对所述酶解产物进行分离纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述色谱复性包括：

步骤(11)色谱柱平衡：用复性缓冲液A平衡SP-Sepharose FF填料；

步骤(12)包涵体溶液上柱：平衡后的填料与rhpro-NGF包涵体溶解液混合，装柱，再用复性缓冲液A平衡；

步骤(13)包涵体柱上线性梯度复性：复性缓冲液A从100％-0，同时复性缓冲液B从0-100％；

步骤(14)复性蛋白洗脱，得到目标组分和非复性组分；

其中，所述复性缓冲液A为25mM Tris-HCl、7-8M尿素、5mM EDTA-Na2、5mM GSH、1mMGSSG pH8.0；所述复性缓冲液B为25mM Tris-HCl、0.5M尿素、5mM EDTA-Na2，5mM GSH、1mMGSSG pH8.0。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过对所述含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体进行菌体裂解处理、rhpro-NGF包涵体的洗涤和溶解，得到rhpro-NGF包涵体溶解液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌体裂解处理包括：用裂解缓冲液按菌液比1:10重悬菌体，采用高压匀浆方式破菌；

所述裂解缓冲液为25mM Tris-HCl、5mM EDTA-Na2 pH8.0；

所述高压匀浆方式破菌包括：200Bar均浆一次，800Bar破碎两次；破菌温度15℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用重组牛肠激酶进行肠激酶酶切。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用组合层析对所述酶解产物进行分离纯化。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述组合层析包括：采用SP-HP和BUTYL-Sepharose FF组合层析对酶解产物进行分离纯化。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体通过重组大肠杆菌高密度发酵和IPTG诱导表达获得。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，表达质粒为pET-30a(+)，菌株为BL21(DE3)；

所述高密度发酵和IPTG诱导表达包括：

在菌体OD600达20时，开始补料培养，补料培养基的流加参数为240mL/h/20L；

在菌体OD600达35时，开始补料诱导，补料培养基的流加参数为60mL/h/20L；

IPTG诱导浓度为0.5mM，诱导4小时；

所述补料培养基为40％甘油+20％酵母粉。

10.一种蛋白包涵体，其特征在于，通过对含肠激酶酶切位点的重组人β-神经生长因子前体蛋白的包涵体进行色谱复性得到。