[发明专利]一种蛋白包涵体及重组人β-神经生长因子的制备方法

说明书

本发明涉及一种蛋白包涵体及重组人β‑神经生长因子的制备方法，对含肠激酶酶切位点的重组人β‑神经生长因子前体蛋白的包涵体进行色谱复性，得到复性前体蛋白，即蛋白包涵体；对复性前体蛋白进行肠激酶酶切，得到酶解产物；对酶解产物进行分离纯化。本发明将色谱法应用到rhpro‑NGF包涵体复性中，相比于传统的稀释复性方法，显著提高复性率，缩短复性时间，使后续纯化更简单，获得结构正确高纯度产品，能够减少蛋白质互相聚集的机会，打破复性变性反应平衡，使复性反应持续进行，以较高的蛋白复性浓度进行，便于去除变性剂，集成复性与纯化过程，可以实现自动化、规模化，层析介质可以重复使用，降低工艺成本，更利于将来产业化的大规模生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，并且更具体地，涉及到一种蛋白包涵体及重组人β-神经生长因子的制备方法。

背景技术

神经生长因子(NGF)是最早被发现的、目前研究最为透彻的一种具有营养神经元胞体并促进神经元轴突生长功能的神经营养因子，动物试验及临床研究表明基于其调控中枢及周围神经元的发育、分化、生长的生理功能，在发生神经损伤后，外源给予NGF可促进损伤神经的修复和再生，因此是一种治疗神经损伤相关疾病的潜在药物。NGF是一个复合蛋白，由α、β、γ三个亚单位组成，其中具有营养和促进神经生长功能的是β亚单位，是两条由118个氨基酸组成的单肽链通过非共价结合形成的二聚体，不同物种间β-神经生长因子(β-NGF)的结构具有高度同源性，生物学功能也没有明显种间差异。

从上世纪90年代开始，国内外多家制药公司和药物研究机构将β-NGF作为一种治疗神经损伤的蛋白药物进行研究开发，但到目前为止，世界上仅有我国的海特、舒泰神、未名医药和丽珠四家公司以及意大利的Dompé公司成功上市了NGF药物。我国上市的四种NGF药物，其活性成分都是鼠β-NGF，从小鼠颌下腺提取，生产上存在鼠源病毒污染的风险且批间质量控制难度大。鼠β-NGF和人β-NGF的同源性为90％，长期应用会产生免疫原性，因此有必要研发人β-NGF药物。从人体组织提取β-NGF很难实现，一方面人体组织中β-NGF分布广、含量低，提取纯化难度大，另一方面组织来源存在伦理问题和安全风险，这些都不利于实现规模化的安全药物生产。因此通过重组表达人β-NGF势在必行。

意大利Dompé公司于2017年上市了世界上第一个重组人β-NGF药物，生产工艺是采用原核表达系统(E.coli)表达重组人β-神经生长因子前体蛋白(rhpro-NGF)包涵体，包涵体经过稀释复性，用胰蛋白酶切掉前导肽后再纯化得到β-NGF蛋白。由于稀释复性率低，且存在因二硫键错配导致构象不正确问题，导致生物学活性比从鼠提取的β-NGF低50倍这样的问题。因此国内外业界更倾向于使用真核系统直接表达人NGF-β来克服这些问题，目前国外使用真核系统大规模表达并纯化人β-NGF已有成熟工艺，如NIBSC提供的重组人β-NGF国际标准品就是用CHO细胞表达的。国内生产鼠β-NGF药物的四家企业，在进行产品升级换代的策略上也是采用CHO细胞表达重组人β-NGF。但是采用CHO细胞生产人β-NGF不能回避的问题是哺乳动物细胞培养成本高，表达量低(50mg/mL)。且由于细胞分泌过程中翻译后修饰或分泌后氨基酸残基侧链发生化学反应或肽链降解而产生了一系列变异体蛋白需要除去，增加了后续纯化的难度和成本。相比之下，使用原核系统生产人β-NGF，成本低，但需要解决包涵体复性上的难点。但目前文献报道的原核表达的rhpro-NGF主要是通过稀释复性。稀释复性的复性率低，复性时间长，运用到生产上时需要很大复性体积，不利于产业化生产，且生产成本较高。

基于此，现有技术仍然有待改进。

发明内容

本发明针对上述问题，目的在于提供一种蛋白包涵体及重组人β-神经生长因子的制备方法，其能显著提高复性率，使后续纯化更简单，获得结构正确高纯度产品，降低工艺成本，更利于将来产业化生产。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明的实施例公开了一种重组人β-神经生长因子的制备方法，其包含以下步骤：