[发明专利]龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法

权利要求书

1.一种人工分离获得的龙葵曲顶病毒，其特征在于，该病毒全基因组序列如序列表SEQNO:1所示；该病毒全基因组序列包含V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4共7个ORF，所述V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4的核苷酸序列分别如序列表SEQ NO:2-8所示；所述V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4编码的氨基酸序列分别如SEQ NO:9-15所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述龙葵曲顶病毒全基因组序列的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物序列如下：

NCTV-F：GCGTTTATAGTGAAATGTTTAGGCAT

NCTV-R：CAAGAATATCTTCCTCACATATCCCAG。

3.一种如权利要求2所述扩增引物的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品采集与RNA提取：将田间发现有病毒症状的龙葵的发病部位剪下，提取植物总RNA；

(2)siRNA深度测序：将提取的样品总RNA进行siRNA建库与测序；

(3)siRNA深度测序数据处理与分析：利用生物信息学软件对测序数据进行原始数据过滤、序列拼接，得到若干contigs；

(4)引物设计：根据病毒来源的上述contigs使用引物设计软件设计特异性病毒全长基因组扩增引物，获得扩增引物序列。

4.一种如权利要求1所述龙葵曲顶病毒全基因组序列获取方法，其特征在于，使用权利要求2所述扩增引物进行扩增，包括如下步骤：

(1)提取病毒侵染的龙葵组织总DNA；

(2)采用所述扩增引物，以所述龙葵组织总DNA为模板，进行PCR扩增；

(3)回收PCR扩增得到的DNA产物，并将其连接到pLB平末端载体，进行DNA测序，得到龙葵曲顶病毒全基因组序列。

5.一种用于检测权利要求1所述龙葵曲顶病毒的特异性检测引物，其特征在于，两对所述检测引物序列如下：

。

6.一种检测权利要求1所述龙葵曲顶病毒的方法，其特征在于，使用权利要求5所述检测引物进行PCR检测。

7.一种如权利要求6所述检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采集疑似感病植物材料，提取疑似感病的植物总DNA；

(2)将步骤(1)终产物植物总DNA稀释到100ng/μl，用所述检测引物进行普通定性PCR扩增；

(3)检测，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带，用1kb DNA marker作为片段大小对照标准，根据电泳图确定检测结果。

8.一种如权利要求7所述检测方法，其特征在于，PCR体系如下：

PCR反应循环的设置如下：