[发明专利]龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法

说明书

本发明提供了龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法，龙葵曲顶病毒全基因组序列全长2867bp，包含7个ORF，编码V1‑V3、C1‑C4七个蛋白，龙葵曲顶病毒全基因组序列、ORF序列及编码蛋白氨基酸序列如SEQ NO：1‑NO：15所示；根据龙葵曲顶病毒全基因组序列设计了两对检测引物，用于检测植物龙葵曲顶病毒；本发明鉴定了引起龙葵曲顶症状的病毒病原为一种新的双生病毒，并获取了该病毒的全基因组序列，ORF序列及编码氨基酸序列，另外设计了两对特异性强、稳定可靠的检测引物，能够高效可靠检测该病毒，为龙葵曲顶病毒的研究及病害防治打下基础。

技术领域

本发明涉及分子生物工程技术领域，具体涉及一种龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法。

背景技术

龙葵是我国传统中药材，历史悠久。近年来由于其药用成分具有显著的抗肿瘤功效，龙葵逐渐引起国内外专家学者的高度重视。随着相关品的不断研发与生产，龙葵作为一种新兴经济作物，逐渐实行人工种植。加工型龙葵作为东北、山东等地的新兴产业，产品品质优良，效益显著、市场前景广阔，在区域经济发展、农业产业结构调整、农业增效和农民增收中的作用日益显著。

近期发现一种龙葵病害普遍发生，呈爆发趋势，感病植株呈现症状植株矮小、叶片扭曲、果实萎缩的症状，严重影响龙葵采收，防治形势不容乐观。龙葵在我国分布广泛，如果任由该病害进一步传播蔓延，将会对我国龙葵产业带来很大影响。此外龙葵属茄科，同科很多重要经济作物(如番茄、马铃薯、茄子)，该病害有可能在茄科经济作物上传播引发新病害。然而，目前暂无龙葵病毒病害报道，缺少对龙葵病害的有效检测手段，导致对该病害无针对性防治方法，造成严重的经济损失。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何确定引起龙葵曲顶症状的病毒病原及如何有效地检测该病毒。

为解决上述问题，一方面，本发明提供引起龙葵曲顶症状的龙葵曲顶病毒全基因组序列，具体序列如序列表SEQ NO：1所示，龙葵曲顶病毒全基因组序列长2867bp。

进一步的，龙葵曲顶病毒全基因组序列包含V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4 7个ORF(开放阅读框)，所述V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4序列如序列表SEQ NO：2-8所示。

进一步的，所述V1、V2、V3、C1、C2、C3和C4编码的氨基酸序列如SEQ NO：9-15所示，各氨基酸序列长度分别为95aa、242aa、82aa、347aa、158aa、134aa、85aa。

另一方面，发明还提供了一种用于扩增所述龙葵曲顶病毒全基因组序列的扩增引物，引物序列如下：

NCTV-F：GCGTTTATAGTGAAATGTTTAGGCAT

NCTV-R：CAAGAATATCTTCCTCACATATCCCAG。

另一方面，本发明还提供了上述扩增引物的获取方法，包括如下步骤：

(1)样品采集与RNA提取：将田间发现有病毒症状的龙葵的发病部位剪下，提取植物总RNA；

(2)siRNA深度测序：将提取的样品总RNA进行siRNA建库与测序；

(3)siRNA深度测序数据处理与分析：利用生物信息学软件对测序数据进行原始数据过滤、序列拼接，得到若干contigs；

(4)根据病毒来源的上述contigs使用引物设计软件设计特异性病毒全长基因组扩增引物，获得扩增引物序列。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述扩增引物获取所述龙葵曲顶病毒全基因组序列的方法，包括如下步骤：

(1)提取病毒侵染的龙葵组织总DNA；

(2)采用所述扩增引物，以所述龙葵组织总DNA为模板，进行PCR扩增；