[发明专利]一种高通量检测8种疫霉菌的分子检测方法

说明书

本发明公开了一种高通量检测8种疫霉菌的分子检测方法。在本发明中，将LAMP技术与96孔板结合建立了一种能够同时检测8种疫霉菌的高通量检测技术。针对8种疫霉菌(寄生疫霉Phytophthora parasitica、Phytophthora tentaculata、致病疫霉Phytophthora infestans、草莓疫霉Phytophthora fragariae、辣椒疫霉Phytophthora capsici、掘氏疫霉Phytophthora drechsleri、恶疫霉Phytophthora cactorum、大雄疫霉Phytophthora megasperma)的同一个靶标基因Ypt1建立了Ypt1‑LAMP检测引物、试剂盒和方法。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好，为疫霉菌的检测提供了高通量快速检测技术，对疫霉菌疫病防治和监测具有重要和深远意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种疫霉菌高通量分子检测方法。

背景技术

疫霉属(Phytophthora)属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)，是一类寄主范围广、发病重且较难控制、对植物产量造成巨大损失的病原卵菌。疫霉属是一个大属，目前被广泛承认的至少有103个种。由于疫霉菌(Phytophthora spp.)对寄主植物的破坏性较强，危害性大，往往导致农业生产的严重损失，因而由疫霉菌所致的植物病害通常称为“疫病”。疫霉属的寄主范围很广，主要侵染果树、林木、蔬菜、花卉、棉、麻、油料等上万种植物，但就不同的疫霉菌而言，其寄主范围相差很大。樟疫霉、烟草疫霉、恶疫霉等寄主范围很广，可以侵染上千种植物；苎麻疫霉、辣椒疫霉等寄主范围较窄；大豆疫霉、豇豆疫霉等仅侵染1-3种寄主植物。然而疫霉菌两个可亲合菌系配合而形成有性器官时，可能发生基因重组，其结果将使病原菌具有更强的生存能力、致病力以及更广泛的寄主范围。在中国由于疫霉菌引起的疫病损失以及疫霉种群的复杂性逐年都在增加，严重威胁人类正常生产生活。因此，研究一种高通量检测鉴定多种疫霉菌的方法，快速了解和掌握当地的疫霉种群和生态，对加强疫情监测、为病害的风险及研究决策提供依据具有重大和深远意义。

传统检测鉴定疫霉菌的方法主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等性状，分离疫霉菌的方法采用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离疫霉菌。为了提高诱捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和杀菌剂抑制杂菌生长。适用于做诱饵的植物材料因不同疫霉菌也有所不同，有很多材料可以用于叶蝶诱捕法，包括柑橘叶片诱捕烟草疫霉、黄瓜果实诱捕掘氏疫霉、松针诱捕樟疫霉、打孔的大豆叶片诱捕大豆疫霉等。为了成功的分离疫霉菌，传统学的方法需要采用选择性培养基获得病原物的纯培养，整套过程费时费力而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。

随着分子生物学技术的发展，普通PCR和实时荧光PCR等技术已经成功应用于各种疫霉菌的检测中。虽然采用PCR技术和实时荧光PCR技术的检测方法具有特异性和灵敏度都较高的优点，但是检测时间仍然比较长，之后的电泳跑胶费时费力，且需要依赖精密且价值较高的PCR仪，不能满足快速检测的需求。而且目前很多检测技术研究都是针对一种疫霉菌，但是在实际情况中，对高通量检测鉴定疫霉菌的需求越来越强烈。Katarzyna Sikora等利用Padlock探针结合microarray芯片技术进行了23种疫霉菌的高通量检测。但这些诊断方法或程序繁琐、周期长，或成本高，同时也需要使用昂贵的仪器和试剂等。