[发明专利]一种敲除fimH基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用有效
| 申请号： | 201910393054.1 | 申请日： | 2019-05-13 |
| 公开（公告）号： | CN110055205B | 公开（公告）日： | 2020-09-01 |
| 发明（设计）人： | 应汉杰;陈天鹏;陈勇;刘娜;任培芳;俞莹;余斌;柳东;欧阳平凯 | 申请（专利权）人： | 南京工业大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/65;C12N15/70;C12P13/08;C12P13/12;C12P7/54;C12P7/46;C12R1/19 |
| 代理公司： | 江苏圣典律师事务所 32237 | 代理人： | 胡建华 |
| 地址： | 210000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 fimh 基因 重组 大肠杆菌 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种敲除fimH基因的重组大肠杆菌在发酵生产氨基酸中的应用，其特征在于，该大肠杆菌fimH基因失活，所述原始大肠杆菌为CIBTS1688；所述氨基酸为赖氨酸或甲硫氨酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌的fimH基因被卡那霉素抗性基因替换。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌的构建步骤如下：
(1)将质粒pKD46电转入原始大肠杆菌中，筛选出带有pKD46质粒的重组菌，培养重组菌，用L-阿拉伯糖诱导，再将L-阿拉伯糖诱导后的重组菌细胞制备成感受态细胞；
(2)以质粒pKD4为模板，PCR扩增得到带有卡那霉素抗性基因序列的敲除片段，所述敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，胶回收敲除片段；
(3)将步骤(2)纯化得到的敲除片段电转入步骤(1)得到的的感受态细胞中，以卡那霉素为抗性标记，筛选得到敲除fimH基因的重组大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增使用的引物核苷酸序列如下：
引物fimH-kan-F：GATTAGCATCACCTATACCTACAGCTGAACCCGAAGAGATGATTGTAATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
引物fimH-kan-R：TACCAGCATTAGCAATGTCCTGTGATTTCTTTATTGATAAACAAAAGTCAGCCATGGTCCATATGAATATCCTCC。
5.一种敲除fimH基因的重组大肠杆菌在发酵生产有机酸中的应用，其特征在于，该大肠杆菌fimH基因失活，所述原始大肠杆菌为CIBTS1688；
所述有机酸为乙酸、苹果酸、富马酸或丁二酸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌的fimH基因被卡那霉素抗性基因替换。
7.根据权利要求5-6任意一项所述的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌的构建步骤如下：
(1)将质粒pKD46电转入原始大肠杆菌中，筛选出带有pKD46质粒的重组菌，培养重组菌，用L-阿拉伯糖诱导，再将L-阿拉伯糖诱导后的重组菌细胞制备成感受态细胞；
(2)以质粒pKD4为模板，PCR扩增得到带有卡那霉素抗性基因序列的敲除片段，所述敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，胶回收敲除片段；
(3)将步骤(2)纯化得到的敲除片段电转入步骤(1)得到的的感受态细胞中，以卡那霉素为抗性标记，筛选得到敲除fimH基因的重组大肠杆菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增使用的引物核苷酸序列如下：
引物fimH-kan-F：GATTAGCATCACCTATACCTACAGCTGAACCCGAAGAGATGATTGTAATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
引物fimH-kan-R：TACCAGCATTAGCAATGTCCTGTGATTTCTTTATTGATAAACAAAAGTCAGCCATGGTCCATATGAATATCCTCC。
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