[发明专利]一种敲除fimH基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种敲除fimH基因的重组大肠杆菌，该大肠杆菌fimH基因失活。本发明进一步提供敲除fimH基因的重组大肠杆菌的构建方法及该重组大肠杆菌在发酵生产氨基酸或有机酸中的应用。本发明借鉴医学上的致病性大肠杆菌形成生物膜的细胞相较于游离的细胞更适应极端环境，在已知fim操纵子调控的fimH基因可以调控大肠杆菌生物膜的形成，通过转录组分析发现了敲除fimH基因后氨基酸及有机酸代谢通路的变化，为后期工业化过程中筛选其他高产氨基酸有机酸的重组菌株做好铺垫，最终达到提高产量、发酵速率和糖转化率的目的。

技术领域

本发明涉及基因重组，具体涉及一种敲除fimH基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

氨基酸在工业生产中应用十分广泛，例如动物饲料添加剂、人类食物调味品以及化妆品和医疗产品的原料。三羧酸循环中，如富马酸和柠檬酸等有机酸在食品添加剂、化学制造及医疗产品领域亦有其广泛应用。目前氨基酸和有机酸的生产的主要方法有三种：微生物发酵法、化学合成法以及酶法。微生物发酵法以其具有生产原料来源广泛、成本低、在生产过程中对环境污染较小、操作容易安全、菌种多种多样并且可以进行大规模生产等优势，现已成为氨基酸和有机酸生产的主流方法。随着分子生物学技术的成熟和发展，运用基因工程技术对菌株的氨基酸和有机酸代谢途径进行分子改造，成为当今获得氨基酸和有机酸高产菌株的有效手段。大肠杆菌作为一种最常用基因工程菌，具有生长快速且稳定、代谢通路清晰、成本低和基因编辑工具易获取等特点。虽然利用大肠杆菌生产苏氨酸普遍运用到微生物发酵实验中，但相对于氨基酸和有机酸行业的需求，其速率依然较慢。因此基因工程菌高产氨基酸的改造成为生产应用中的关键。

菌毛在大肠杆菌中主要负责细胞的运动，其主要作用是负责细菌细胞之间、细菌与非生物表面的黏附，并且与生物膜的形成和DNA的转移等相关联。大肠杆菌I型菌毛是重要的黏附细胞器，该菌毛由fim操纵子编码，由9个基因组成，分别是fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimS，这些基因是I型菌毛的主要结构单位，是菌毛重要部分。生物膜(Biofilm)是一种复杂的细胞群落、由细胞外基质形成了复杂的生物聚集体，具有保证细菌在极端环境下生存的能力。大肠杆菌就可以通过菌毛的运动和黏附逐渐形成不可逆的粘附于非生物或生物表面的生物膜。

发明内容

发明目的：本发明构建了一种敲除生物膜关键基因fimH的重组大肠杆菌，通过原始菌和敲除菌株的全基因转录组分析，证实了改造fimH基因可以影响氨基酸和有机酸代谢途径流。

技术方案：本发明提供了一种敲除fimH基因的重组大肠杆菌，该大肠杆菌fimH基因失活。

所述大肠杆菌为CIBTS1688。大肠杆菌CIBTS1688赠自中国科学院上海生命科学研究院，所述大肠杆菌CIBTS1688已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015233，菌株号为CIBTS1688，其具体信息已在申请号为2015101990361的发明专利中公开。

所述大肠杆菌的fimH基因被卡那霉素抗性基因替换。

本发明进一步提供敲除fimH基因的重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将质粒pKD46电转入原始大肠杆菌中，筛选出带有pKD46质粒的重组菌，培养重组菌，用L-阿拉伯糖诱导，再将L-阿拉伯糖诱导后的重组菌细胞制备成感受态细胞；

(2)以质粒pKD4为模板，以下面所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增得到带有卡那霉素抗性基因序列的敲除片段，所述敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，胶回收敲除片段；

引物fimH-kan-F：GATTAGCATCACCTATACCTACAGCTGAACCCGAAGAGATGATTGTAATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC