[发明专利]一种用透射电镜原位观察单层细胞间细胞连接的方法

权利要求书

1.一种用透射电镜原位观察单层细胞间细胞连接的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）细胞准备：将经过灭菌的Epon-812环氧树脂薄片放入培养板中，将单层细胞经过离心、重悬，均匀加入有Epon-812环氧树脂薄片的基板中，放入培养箱进行培养，所述单层细胞为人胰腺导管上皮细胞HPDE6C7；

（2） 标本固定、脱水、浸透：

a、标本固定：将步骤（1）培育好的细胞加入戊二醛固定液，在4℃下放置12h，使用0.1mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次，每次8min；再使用1%锇酸固定1h后，使用0.1mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次，每次8min；

b、乙醇逐级脱水：50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇分别脱水一次，100%乙醇脱水3次，以上各级脱水每次8min；

c、浸透：使用纯Epon-812环氧树脂浸透树脂薄片，放入40℃烘箱2h；

（3）标记区域、修块、预包埋：

a、使用标记笔标记出细胞生长密集的区域并将标记区域修剪出来得到细胞密集块；

b、纯Epon-812环氧树脂预包埋：预先在树脂包埋板中滴两滴树脂， 细胞密集块的细胞面朝下靠近包埋板底部一端，消除多余的气泡，并使得整个细胞密集块保持水平，使得细胞面与包埋板底面平行；

c、使用纯Epon-812环氧树脂包埋剂滴满树脂包埋板，放入40℃、48℃、60℃烘箱中分别聚合15h、12h、24h；

（4）预包埋块再修块、重包埋：

a、标记出步骤（3）预包埋块中的细胞密集块细胞面与底边平行的部位，对细胞密集块进行打磨切割成立方体树脂小块；

b、纯Epon-812环氧树脂重包埋：预先在树脂包埋板中滴两滴树脂，将修切好的预包埋块放入树脂包埋板，细胞面朝外且与包埋板底面垂直；

c、使用纯Epon-812环氧树脂包埋剂滴满树脂包埋板，放入40℃、48℃、60℃烘箱中分别聚合15h、12h、24h；

（5）切片、染色、电镜观察：

a、将重包埋好的细胞密集块使用切片机切片，切成厚度为1um的半薄切片，染色定位细胞层，根据半薄切片图像提示选取目标区域，以目标区域为中心用钻石刀切厚度为70nm的薄切片，得到完整的单层细胞断面；

b、切片使用醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，冲洗、晾干；

c、透射电镜下观察细胞连接。

2.根据权利要求1所述用透射电镜原位观察单层细胞间细胞连接的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所述灭菌的Epon-812环氧树脂薄片采用的灭菌方式为使用紫外灯双面照射。

3.根据权利要求1所述用透射电镜原位观察单层细胞间细胞连接的方法，其特征在于：所述细胞在培养箱的培养条件为:37℃、5%CO₂。

4.根据权利要求3所述用透射电镜原位观察单层细胞间细胞连接的方法，其特征在于：加入培养基板的人胰腺导管上皮细胞HPDE6C7的细胞密度为1×10^6个/ml/孔。

5.根据权利要求4所述用透射电镜原位观察单层细胞间细胞连接的方法，其特征在于：所述步骤（3）a中细胞密集块长宽高为3mm×3mm×0.5mm。