[发明专利]一种用透射电镜原位观察单层细胞间细胞连接的方法

说明书

本发明涉及细胞观察技术领域，尤其是涉及一种用透射电镜原位观察单层细胞间细胞连接的方法，包括以下步骤：(1)细胞准备：将经过灭菌的环氧树脂薄片放入培养板中，单层细胞经过离心、重悬，均匀加入有环氧树脂薄片的基板中，放入培养箱进行培养；(2)标本固定、脱水、浸透；(3)标记区域、修块、预包埋；(4)预包埋块再修块、重包埋；(5)切片、染色、电镜观察：通过以上步骤，本发明可最大程度地、原位地还原了单层细胞的原貌。相较于传统方法而言，本发明减少了对细胞连接的损害；相较于国外原位包埋方法而言，树脂作为细胞生长的载体比用玻璃载玻片更简单、易行，并且本发明预包埋及重包埋方法更加稳定、有效。

技术领域

本发明涉及细胞观察技术领域，尤其是涉及一种用透射电镜原位观察单层细胞间细胞连接的方法。

背景技术

细胞连接是细胞间的联系结构，由细胞质膜局部区域特化形成，在结构上包括膜特化部分、质膜下胞质部分及质膜外细胞间部分。多细胞生物体中，细胞连接的生物网络广泛存在，相邻细胞之间通过质膜相互联系，形成了复杂的生物通信系统。透射电镜能够对原位组织、培养细胞、悬浮细胞中提取的细胞内和细胞外物质进行独特而有价值的研究。

传统贴壁培养细胞的透射电镜制样方法是：胰酶消化或细胞刮刮取培养瓶中的细胞，离心成细胞团块，进行固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色，最后透射电镜下观察。胰酶消化使细胞间结合处蛋白降解，细胞刮刮取会对细胞产生机械性损伤，这两种方法使得细胞形态和细胞间相互关系发生改变，透射电镜下观察细胞连接效果差。

传统原位包埋的透射电镜制样方法是：将培养有细胞的载物倒扣于树脂胶囊上，或直接将树脂胶囊倒扣于细胞培养容器上，聚合后将胶囊切下进行切片观察。这两种方法均容易出现细胞缺失的孔洞，在浸透使用包埋剂时，容易导致细胞变形皱缩、出现裂隙，最终影响超微结构的观察效果。

目前透射电镜观察下原位观察单层细胞方法是：以玻璃盖玻片作为细胞生长载体，对细胞进行固定、脱水、玻片表面树脂包埋；静置一段时间后用氢氟酸将玻璃盖玻片完全腐蚀，树脂包埋部分用钻石切割仪切割，在距离细胞层面1-2mm处停下；将树脂薄片置于载玻片上，光学显微镜下用永久性标记笔标出圆形目标区域，其后将树脂薄片置于热盘上1min，在圆形标记区域中对需要用于研究的区域进行直线切割成等边三角形；取一个00号BEEM^TM胶囊，切掉锥形底部，形成开放式的圆柱体，将三角形树脂薄片放在底面上，滴一滴树脂，静置聚合；将聚合后的块状树脂中包括原先标记区域的部分切割成U形，垂直放置于BEEM^TM胶囊上，滴一滴树脂，静置聚合；将标记区域切割成四边形，用钻石刀切割成600nm的半薄切片，加入理查森染料1min，洗净、热蒸发、室温保存；再切割成100nm的薄切片，收集在铜网格上，干燥后置于内衬滤纸的培养皿中；醋酸铀溶液和枸橼酸铅溶液双重染色，冲洗干净后透射电镜下观察。该方法主要是应用于原位观察施万细胞及施万细胞背根神经节的结构，其不足之处在于：用玻璃载玻片作为细胞生长载体，需要氢氟酸侵蚀玻璃后才能保留树脂标本，氢氟酸会对树脂表面的细胞标本或对本发明所需观察的细胞连接造成一定的影响；BEEM^TM胶囊上U形垂直包埋操作要求精细，否则重力作用易使得树脂包埋不完全；标本需要经过一次玻璃侵蚀、三次树脂包埋、多次切割，耗费时间长，所需耗材贵重，步骤繁杂。

因此，寻找一种能够原位地、直观地、有效地用透射电镜观察细胞连接的形态学方法至关重要。

以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种能减少细胞损伤，更大限度保持细胞完整性并且可清晰地观察到单层细胞间的细胞连接的方法是目前所急需的。

为了实现上述问题，本发明采用的技术方案为：