[发明专利]一种牙龈干细胞的分离、培养方法及其应用

说明书

本发明公开一种牙龈干细胞的分离、培养方法及其应用，分离培养方法包括对牙龈组织采用质量体积浓度小于0.3％的胶原酶‑磷酸盐缓冲液进行消化处理。本发明的分离方法仅采用Ⅰ型胶原酶消化处理牙龈组织，获得的原代牙龈干细胞数量多，而且活率高；而且分离速度快，处理时间短，显著降低了制备干细胞的成本；本发明方法分离培养的牙龈干细胞在青光眼手术后能显著延长滤过泡由功能性滤过泡过度到非功能滤过泡发生的时间，保持房水滤过道的流畅，使得房水能顺畅流畅，避免术后眼压再次升高，具有增强抗青光眼滤过术后滤过功能的作用，提高了青光眼手术成功率。

技术领域

本发明涉及一种干细胞原代分离及培养方法，特别是涉及一种牙龈干细胞的分离、培养方法及牙龈干细胞的应用，属于干细胞培养领域。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。间充质干细胞具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力、向组织损伤部位定向迁移、促进组织修复、保护神经和调节免疫的作用。目前在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入.可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，可以分化为间叶和非间叶细胞谱系，是组织工程和再生医学研究中的重要种子细胞，因此临床应用价值不菲。

发现MSC具有免疫调控作用是干细胞研究领域中的一项重要突破，研究表明MSC可直接抑制T细胞的增殖、分化功能，也可通过抑制树突状细胞的分化和成熟，间接抑制T细胞。MSC还可调节自然杀伤性细胞、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等的增殖、活化以及细胞因子的分泌和细胞毒活性等，并上调调节性T细胞(Treg细胞)，最终诱导抗炎效应和(或)免疫耐受状态。尽管如此，但MSC对于组织减少瘢痕的作用尚无研究报导。

青光眼是一类严重危害人类视觉健康的严重疾病，眼压增高导致视神经损伤，甚至出现萎缩，形成视功能不可逆转的损害，最终导致失明。抗青光眼滤过手术通过将房水引流到结膜瓣下，减少了眼内的放水量，从而达到降眼压的目的。但抗青光眼术后瘢痕形成，阻塞房水流畅的滤过道，导致房水不能顺畅流畅，眼压再次升高，青光眼手术失败。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速有效并且成本较低的牙龈干细胞分离、培养方法以及制备的牙龈干细胞在制备抗青术后滤过功能障碍的药物中的应用。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种牙龈干细胞的分离、培养方法，包括对牙龈组织进行消化处理，其中所述消化处理过程中消化牙龈组织的消化液为质量体积浓度小于0.3％的胶原酶-磷酸盐缓冲液。

其中，所述胶原酶-磷酸盐缓冲液的质量体积浓度优选为0.2％-0.3％，进一步优选为0.25％。

特别是，所述胶原酶-磷酸盐缓冲液为Ⅰ型胶原酶-磷酸盐缓冲液。

尤其是，所述消化液按照如下方法制备而成：将质量体积浓度为1％的Ⅰ型胶原酶储存液用磷酸盐缓冲液稀释至质量体积浓度小于0.3％，优选为0.2％-0.3％，进一步优选为0.25％。

特别是，所述消化处理时间为25-40min；消化处理温度低于37℃；优选为35-37℃。

尤其是，所述消化处理在37℃，5％CO2，饱和湿度的标准环境下进行。

本发明另一方面提供一种牙龈干细胞的分离、培养方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)将拔牙手术取下的牙齿清洗后，刮取牙齿根部的牙龈组织，并对牙龈组织进行剪切处理，制成预处理牙龈组织；

2)将预处理的牙龈组织置于消化液中，进行牙龈组织的消化处理，获得牙龈组织消化混合液；