[发明专利]高密度灌注培养重组CHO细胞生产人促卵泡激素的方法、培养基及其应用

说明书

本发明公开了一种高密度培养重组CHO细胞生产人促卵泡激素的方法、培养基及其应用，属于生物制药领域，制备方法包括：将CHO细胞复苏后，使用基础培养基进行细胞密度扩增；当活细胞密度达到一定密度后，使用生产培养基进行灌注培养：新鲜生产培养基补加到生物反应器罐体内，反应器罐体外连接的中空纤维截留装置使CHO细胞被截留，使细胞能够维持很高的密度和活力；当反应器内细胞处于稳定状态时，开启CHO细胞表达产物收集。本发明通过生物反应器搅拌培养和外接细胞截留装置可以截留细胞，过滤碎片和表达的蛋白，为细胞生长提供高密度环境，同时中空纤维柱的反向冲洗，降低了纤维堵塞，延长了细胞的高密度培养时间，显著提升批次产量。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种高密度灌注培养重组CHO细胞生产人促卵泡激素的方法、培养基及其应用。

背景技术

人促卵泡激素(human follicle stimulating hormone,hFSH)是垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，属于异二聚体糖蛋白家族，由独立的基因分别编码的两条非共价连接的α链和β链组成。最初医学使用的促卵泡激素是从绝经期妇女的尿液中提纯的，存在人源蛋白污染的风险，而且批次间产品差异较大，很难满足市场的需求(Prevost R R.Recombinant Follicle-Stimulating Hormone:New Biotechnology forInfertility[J].Human Reproduction Update,1998,18(5):1001-1010.)。随着分子生物学的快速发展，市场上出现了重组人促卵泡激素产品，纯度更高，没有人源蛋白污染，批间一致性和安全性更高，副反应更低(Santi D,Simoni M.Biosimilar recombinantfollicle stimulating hormones in infertility treatment[J].Expert Opinion onBiological Therapy,2014,14(10):1399-1409.)。

大多数FSH产品都是通过重组中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary cell，CHO)生产的。在培养上，最初采用含有血清的培养基进行转瓶或微载体纸片贴壁培养(Recombinant follicle stimulating hormone:development of the firstbiotechnology product for the treatment of infertility.Recombinant Human FSHProduct Development Group.hum Reproduction Update.1998,4(6):862-881)，添加血清有潜在的动物病毒感染的风险，且不利于纯化。随着无血清培养基的出现，国内有了关于大规模悬浮培养工艺研究的报道(CHO细胞表达rhFSH的大规模无血清培养工艺的研究，吉林大学，2012)，但该工艺在种子复苏阶段仍需要添加血清，后期虽然去除了血清，但表达量不高。

中国专利CN 105462909 A中提到了一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞的培养方法，从种子复苏到细胞培养，全程采用商业化无血清培养基和补料培养，细胞最高密度可达4×10⁷个/ml，表达量达到40mg/L，5L反应器批次生产可达到140mg，但细胞培养时间较短，批次产量仍然不高。

因此，提供一种能够提高批次产量、安全高效表达人促卵泡激素的培养方法显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高批次产量、安全高效的高活细胞密度(Variable cell density，VCD)培养重组CHO细胞生产人促卵泡激素的方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种高密度灌注培养重组CHO细胞生产人促卵泡激素的方法，包括如下步骤：