[发明专利]表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用

权利要求书

1.一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述的重组火鸡疱疹病毒为在火鸡疱疹病毒的编码序列的非必需复制区中的HVT-065和HVT-066基因之间的非编码区插入外源基因表达盒；

所述的外源基因表达盒由MCMV启动子、外源基因和SV40 poly A依次连接而成；

所述的外源基因为H7HA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的MCMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的SV40 poly A的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒FC126株。

2.根据权利要求1所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：

所述的重组火鸡疱疹病毒的分类命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA，保藏编号为CCTCC NO:V201914，于2019年4月29日保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心。

3.一种表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)构建转移质粒pG-65/66-H7HA

①以火鸡疱疹病毒的总DNA为模板，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为引物，进行PCR扩增，得到左同源臂L1片段；同时，以SEQ ID NO:6和为SEQ ID NO:7引物，进行PCR扩增，得到右同源臂R1片段；

②用引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9融合左同源臂L1片段和SV40 polyA序列，得到L2片段；用引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10融合右同源臂R1片段和MCMV启动子序列，得到R2片段；

③将L2片段和R2片段用限制性内切酶Aflii进行酶切，然后用T4连接酶连接L2酶切后的产物和R2酶切后的产物，得到L2+R2片段；最后将L2+R2片段克隆到pGEM-T-Vector上，得到重组质粒pG-65/66；

④利用限制性内切酶Aflii和NheI，以及T4连接酶将H7HA片段亚克隆到重组质粒pG-65/66中，得到转移质粒pG-65/66-H7HA；其中，H7HA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)构建和纯化重组火鸡疱疹病毒rHVT-H7HA

⑤将火鸡疱疹病毒接种原代鸡胚成纤维细胞，得到感染亲本病毒的细胞；接着将转移质粒pG-65/66-H7HA线性化后电转染感染亲本病毒的细胞，然后在37℃条件下培养至细胞病变，经过鉴定、筛选和富集，得到感染重组病毒的细胞；

⑥将感染重组病毒的细胞重悬在SPGA缓冲液中，然后进行超声破碎提取游离的病毒粒子，筛选能够表达H7亚型禽流感病毒HA蛋白的重组病毒火鸡疱疹rHVT-H7HA，即为所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒。

4.根据权利要求3所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于：

步骤⑥中所述的超声破碎的条件为：功率140W～220W，时间2min。

5.根据权利要求3所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于：

步骤①中所述的火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒(HVT)FC126株；

步骤②中所述的SV40 poly A的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

步骤②中所述的MCMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求3所述的表达H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于：

步骤①中所述的SPGA缓冲液配方如下：蔗糖0.218M，磷酸二氢钾0.0038M，磷酸氢二钾0.0072M，谷氨酸钠0.0049M，牛血清白蛋白1％(w/w)。