[发明专利]一种香蕉A、B基因组的分型方法

权利要求书

1.一种香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)DNA提取：提取待检测样品的总DNA；

(2)尖叶蕉、长梗蕉基因组区分：以待检测样品的总DNA作为模板，利用引物ITS L-F:5'-TCGTAACAAGGTTTCCGTA GGTG-3'/ITS 4-R:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'进行PCR-RFLP扩增；将扩增产物纯化回收，经AfaI酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，若酶切后只扩增出一条530bp的特异带，则待检测样品只含尖叶蕉基因组，若酶切后扩增出大小分别为350bp和180bp的特异带，则待检测样品只含长梗蕉基因组，若酶切后扩增出大小分别为530bp、350bp、180bp的特异带，则待检测样品既含尖叶蕉基因组又含长梗蕉基因组；

(3)长梗蕉基因组个数确定：以待检测样品的总DNA作为模板，使用单引物Gy LTRev5'-CTTAGGCAAAACCAGCTAAGTCCG-3'进行IRAP扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增出大小为350bp的特异带，则待检测样品含有长梗蕉基因组，而只含有尖叶蕉基因组的待检测样品不会显示350bp条带；将含有长梗蕉基因组的待检测样品进行特异性扩增，以含有长梗蕉基因组的待检测样品的总DNA作为模板，使用引物BFor:5'-AGGGT TCGAAGTATAGGTTCGG-3'/BRev:5'-AATGTTTAAGTAGAGGGCAAGACG-3'进行扩增，将扩增产物纯化回收，经AluI酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，若酶切后只扩增出一条200bp的特异带，则待检测样品只含有1个长梗蕉基因组，若酶切后扩增出两条200bp的特异带，则待检测样品含有2个长梗蕉基因组，以此确定长梗蕉基因组的个数；

(4)香蕉种质资源基因型确定：采用流式细胞仪对香蕉的倍性进行鉴定，结合步骤S2尖叶蕉、长梗蕉基因组的区分结果，以及步骤S3长梗蕉基因组的个数确定结果，确定香蕉种质资源基因型。

2.根据权利要求1所述的香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，所述步骤S2的PCR-RFLP扩增反应体系包括：DNA模板1.0μL，PCR Mix 27μL，引物ITS L/ITS 4各1.0μL，加ddH₂O至终体积为50μL；反应热循环为：首先94℃预变性4min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃冷却取出。

3.根据权利要求1所述的香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，所述步骤S3的IRAP扩增反应体系包括：DNA模板0.5μL，PCR Mix 10.5μL，引物Gy LTRev 1.0μL，加ddH₂O至终体积为25μL；反应热循环为：首先94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min+3s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃冷却取出。

4.根据权利要求1所述的香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，所述步骤S3的将含有长梗蕉基因组的待检测样品进行特异性扩增的反应体系包括：DNA模板0.4μL，PCR Mix10.6μL，引物对BFor/BRev各0.5μL，加ddH₂O至终体积为20μL；反应热循环为：首先94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸7min，4℃冷却取出。

5.根据权利要求1所述的香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，所述步骤S4的采用流式细胞仪对香蕉的倍性进行鉴定，是以Calcutta4二倍体作为内参进行测定的。