[发明专利]基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的引物、探针、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的引物、探针、试剂盒及应用。上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。除所述的引物、探针外，所述试剂盒还包括测流层析试纸条、测流层析试纸条缓冲溶液、RPA酶、缓冲液、醋酸镁溶液、ddH₂O、对照品中的一种或几种。本发明还公开了所述的检测菜豆普通花叶病毒的方法。本发明基于菜豆普通花叶病毒CP基因设计了特定引物和探针，再应用重组酶聚合酶扩增‑测流层析的方法制备了试剂盒，敏感性高，特异性强，诊断准确，整个检测过程只需30分钟，结果的判定极其简便。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测菜豆普通花叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及应用。

背景技术

菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus，BCMV)是仅次于大豆花叶病毒病的一种豆科植物病毒病，在国内分布也较为普遍，田间感病率较高，侵染范围较广，可以侵染多种菜豆属的植物，如大豆、蚕豆、小豆、绿豆、洋刀豆、决明、鹰嘴豆、豌豆等豆类。BCMV传播途径比较多，常见的有蚜传、种传和花粉传毒，也可通过机械摩擦接种到不同属的植物上。蚜虫获毒期一般仅为15-60s，获毒后，lmin内即可传毒，因而通过蚜虫传毒效率很高。由于BCMV寄主范围大，传播方式多，所以该病毒在国内外引起极大的重视。

目前，检测菜豆普通花叶病毒的方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附法(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光PCR法。指示植物检测法比较简单，但其检测速度很慢，而且无法确定侵染病毒的种类，灵敏度也较低。国内外已有很多利用ELISA方法检测菜豆普通花叶病毒的报道，该方法灵敏度高，操作简单，但所需检测时间也在1～2天，而且抗体制备周期长，费用较高，灵敏度不及RT-PCR。利用分子生物学技术建立的RT-PCR、免疫捕捉RT-PCR、实时荧光RT-PCR及探针杂交检测等方法，使得菜豆普通花叶病毒的检测结果更为快速、灵敏、准确。但传统基于PCR的方法需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的热循环仪来进行，限制了其使用范围。因此许多不依赖PCR仪的等温扩增技术被发明出来，尤其以LAMP应用最为广泛。

RPA(Recombinasepolymeraseamplifcation)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮组下使模板DNA解链，引物于模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。

发明内容

发明目的：针对现有技术中未存在RPA法检测菜豆普通花叶病毒的问题，本发明的目的之一是提供了基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的引物、探针、试剂盒，本发明的另一目的是提供上述引物、探针、试剂盒的应用，本发明的目的之三是提供一种检测菜豆普通花叶病毒的方法。

技术方案：本发明所述的基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的引物和探针组合，其特征在于，包括：

上游引物：5′-TTAGATCATCTGTTGGATTACAAGCCAGAACA-3′；

下游引物：[5’BIOTIN]CACCACACCATAAAGCCATTCATCACAATTGA-3′；

探针：[5’FAM]ACAAAGATGCAGTTTGAAATGTGGTACAAT[THF]CTGTGAAGGAAGAGTA[3’BLOCK]。

本发明还提供了一种基于RPA技术检测菜豆普通花叶病毒的试剂盒，包含所述的引物和探针组合。