[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，所述检测引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-CAGCGTCAGCTTCTATAG-3’；

下游引物：5’-GTCAGGATTCCACACTTTAGCTA-3’；

所述探针的核苷酸序列为：5’-TCCACTACGATACATAATACCGCA-3’；

其中，所述探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光猝灭基团。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ。

3.权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的应用。

4.一种包含权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针的试剂盒。

5.权利要求4所述的试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒中的应用。

6.一种猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，其特征在于，包括：

步骤1：靶标基因筛选；

步骤2：靶标基因拷贝数荧光定量PCR检测方法建立；

步骤3：基于病毒RNA荧光定量PCR检测方法建立。

7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，其特征在于，所述步骤1具体为：

11)根据已有的PEDV基因组序列，选取病毒组装相关的若干个病毒ORF，应用DNASTART软件设计特异性引物和探针；

12)用TRIzol Reagent提取PEDV未灭活半成品以及灭活半成品总RNA；

13)使用反转录试剂盒进行总RNA的反转录，得到cDNA模板；

14)采用qPCR试剂盒检测上述基因的表达量

反应体系为Mix 10μL、ROX 0.4μL、10μmol/L的引物PEDV-FP和PEDV-RP各0.4μL、10μmol/L的探针PEDVprobe 0.4μL、cDNA模板2μL、补水至20μL；

5)荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s、56℃延伸40s，40个循环，于56℃时采集荧光信号；

6)荧光定量RT-PCR检测结，选取在PEDV半成品灭活前被检出，灭活后不被检出的基因作为靶标基因。

8.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：

21)以猪流行性腹泻病毒基因组cDNA为模板，采用权利要求1所述的上、下游引物进行PCR反应，扩增目标片段，将获得的目标片段分别连接克隆载体，构建包含目标片段的阳性质粒；

22)标准曲线的建立

测定其浓度，根据阳性质粒的浓度计算拷贝数，并将阳性质粒做10倍系列梯度稀释，然后分别以每一稀释浓度的重组质粒作为质粒标准品，进行荧光定量PCR，生成猪流行性腹泻病毒的质粒拷贝数-CT值的标准工作曲线。

9.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，其特征在于，所述步骤3具体为：将待测样品的CT值带入标准工作曲线中，即可判断样品中猪流行性腹泻病毒的病毒含量。