[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针

说明书

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针，属于病毒检测技术领域。上述检测引物的核苷酸序列为：上游引物：5’‑CAGCGTCAGCTTCTATAG‑3’；下游引物：5’‑GTCAGGATTCCACACTTTAGCTA‑3’；所述探针的核苷酸序列为：5’‑TCCACTACGATACATAATACCGCA‑3’；其中，所述探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光猝灭基团。本发明能提高PEDV灭活检测的效率，检测周期能由5‑6天缩短为1‑2天，检测周期短，提升了灭活检测的敏感性和客观性的同时提高了疫苗生产的效率和疫苗成品的安全性。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体是提供一种猪猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针及使用其进行猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性的，高度传染性的，以严重水样呕吐和腹泻及脱水为特征的肠道病毒性疾病，主要危害新生仔猪，死亡率高达100％。

猪流行性腹泻病毒灭活检验是灭活疫苗制备中重要的一环，但传统病毒灭活检测方法是通过细胞盲传3代，观察每代细胞是否出现CPE(致细胞病变效应)，整个过程约需9-10d左右的时间，大大延长了疫苗生产周期，降低了疫苗的生产效率；同时细胞盲传病变检测主观性强，结果随不同检测人员和不同检测条件而有所差异。因此急需建立一种猪流行性腹泻病毒灭活快速、客观检验方法。实时荧光定量PCR技术在病毒检测方面具有灵敏性高、精确性好、特异性强和安全快速等优点。但该技术未应用于猪流行性腹泻病毒灭活检验，主要技术难点在于从猪流行性腹泻病毒基因序列中挑选未彻底灭活病毒的靶标基因，需要设计特异性引物并进行筛选。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针及使用其进行猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，该方法可以显著缩短疫苗生产灭活检测周期，而且灭活检验结果判读更客观，灵敏性更高，特异性更强，且精确性更好。可显著提高疫苗的生产效率。

为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：

一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针，所述检测引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-CAGCGTCAGCTTCTATAG-3’；

下游引物：5’-GTCAGGATTCCACACTTTAGCTA-3’；

所述探针的核苷酸序列为：5’-TCCACTACGATACATAATACCGCA-3’；

其中，所述探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光猝灭基团。

进一步的，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ。

另一方面，本发明提供一种上述猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的应用。

再一方面，本发明提供一种包含上述猪流行性腹泻病毒灭活荧光定量PCR检测引物和探针的试剂盒，及上述试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒中的应用。

再一方面，本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒灭活快速检验的方法，包括：

步骤1：靶标基因筛选；

步骤2：靶标基因拷贝数荧光定量PCR检测方法建立；

步骤3：基于病毒RNA荧光定量PCR检测方法建立。

进一步的，所述步骤1具体为：