[发明专利]血源性女性自体生殖干细胞的制备方法、试剂盒及应用

说明书

本发明涉及血源性女性自体生殖干细胞的制备方法、试剂盒及应用，利用女性自体血液细胞作为原料细胞，通过非转基因的生产血源性女性自体生殖干细胞技术和方法。这种血源性女性自体生殖干细胞的制备方法，包括：将女性自体血液细胞在细胞培养液O1中培养3天；在细胞培养液O2中继续培养6‑9天；然后在细胞培养液O3中继续培养6‑9天；以及收集血源性女性自体生殖干细胞；本发明还提供了一种用于制备血源性女性自体生殖干细胞的试剂盒。使用本发明的方法及试剂盒在血源性女性自体生殖干细胞的取材、生产速度、产量、纯度方面具有显著优势。

技术领域

本发明涉及血源性女性自体生殖干细胞的制备方法、试剂盒及应用，属于生物医学技术领域，具体而言，本发明涉及一种使女性的血液细胞逆向分化产生血源性自体生殖干细胞的细胞培养方法、干细胞及应用。

背景技术

在雌性哺乳动物中，生殖腺里的生殖干细胞来源于一种从胚胎传留下来的数量稀少的生殖干细胞。胚胎形成及卵巢形成的过程中，生殖干细胞就定居于卵巢，主导卵巢分化、发育和成熟。生殖干细胞发育依次形成卵原细胞►初级卵泡►次级卵泡►成熟卵泡►卵子。生殖干细胞具有Mvh⁺和Dazl⁺阳性的特异细胞表型。卵巢的生殖干细胞在产生卵泡及卵子的过程中是一个缓慢的消耗过程。女性一生中，大约经过400至500次卵泡发育成熟、排卵和月经形成后，卵巢中的生殖干细胞就会逐步消耗枯竭，卵巢不再产生卵细胞和卵泡，雌激素的主要来源也同时发生枯竭，卵巢萎缩变小，卵巢衰老丧失生殖功能，女性进入老年。

国内外学者发明了一些生殖干细胞的制备方法，例如通过自然胚胎干细胞体外分化，产生生殖干细胞，或通过iPS多能干细胞（转基因性干细胞）体外分化，产生生殖干细胞，或通过卵巢组织分离培养制备生殖干细胞，分离培养耗时困难，获取数量极其稀少。

生殖干细胞是卵巢的重要种子细胞，对卵巢的结构具有再生性修复作用，所以，自体生殖干细胞的生产技术在女性生殖系统的疾病和损伤的治疗领域，在女性不孕的修复治疗应用领域，在卵巢抗衰老保健领域以及建立自体生殖干细胞储存库领域的应用，都有着十分重要的价值和意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：

1. 应用人自体血液细胞作为更方便更简易的逆向分化生产人自体生殖干细胞的自体原料细胞；

2. 研发一组由各种小分子物质组成的能使人的体细胞逆向分化产生人血源性生殖干细胞的细胞培养液配方；

3. 应用小分子物质组成的细胞培养液配方，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，快速使人的自体血液细胞逆向分化产生人血源性生殖干细胞，这种新型自体干细胞。

为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是：

1. 提供1组使人的体细胞逆向分化产生人血源性自体生殖干细胞的细胞培养液配方;

2. 提供采用该细胞培养液配方使人的体细胞产生血源性生殖干细胞的技术方法;

3.提供通过上述方法获得的生殖干细胞的试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

将女性自体血液白细胞作为原料细胞以2×10⁶ 的密度接种于细胞培养皿中。原料细胞包括但不限于女性的脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞等。

在37℃和5% 的CO2 的环境中，将自体原料细胞在细胞培养液O1（RPMI 1640培养液）中培养3天。培养液O1中含有：

2-10%的血清替代品(KSR)，优选值为5%；

EPO 1-1000 ng/ml，优选值为10ng/ml；