[发明专利]一种细胞组合物在癌细胞NCI-H1975上的应用在审
申请号: | 201910404770.5 | 申请日: | 2019-05-16 |
公开(公告)号: | CN110272870A | 公开(公告)日: | 2019-09-24 |
发明(设计)人: | 邢永梅;邓蒙蒙;程箫;刘丹;吴疆;王保如 | 申请(专利权)人: | 安徽瑞达健康产业有限公司 |
主分类号: | C12N5/0783 | 分类号: | C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00 |
代理公司: | 合肥方舟知识产权代理事务所(普通合伙) 34158 | 代理人: | 刘跃 |
地址: | 230000 安徽省合肥市高新区*** | 国省代码: | 安徽;34 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 细胞组合物 治疗 癌细胞 应用 杀伤 扩增 诱导 癌症 疾病 | ||
1.一种细胞组合物在癌细胞NCI-H1975上的应用,其特征在于:γδT细胞和NK细胞组合物在癌细胞NCI-H1975上的应用。
2.根据权利要求1所述细胞组合物在癌细胞NCI-H1975上的应用,其特征在于:γδT细胞和NK细胞比例为1:0.5-10。
3.根据权利要求2所述细胞组合物在癌细胞NCI-H1975上的应用,其特征在于:γδT细胞和NK细胞制备方法如下:
(1)γδT细胞的获得;
(2)NK细胞的获得;
(3)γδT细胞和NK细胞混合细胞物诱导扩增共培养;
(4)15-20天γδT细胞和NK细胞混合细胞的获得。
4.根据权利要求3所述细胞组合物在癌细胞NCI-H1975上的应用,其特征在于:γδT细胞的获得方法为:
(1)单个核细胞的制备:分离单个核细胞,用含体积百分比50%-100%的含10vt%FBS或自体血清的RMPI 1640和0%-50%X-vivo15的混合培养基重悬细胞,接种在培养瓶或培养袋中培养;
(2)γδT细胞的诱导:加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500~3000U/mL IL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10~500ng/mL anti-human CD3Ab、10~500ng/mL anti-human CD28Ab、10~200ng/mL IL-15、10~200ng/mL IL-21、500~3000U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;
(3)培养2~3天,待γδT细胞生长状态良好待后续使用。
5.根据权利要求3所述细胞组合物在癌细胞NCI-H1975上的应用,其特征在于:NK细胞的获得包括如下步骤:(1)分离单个核细胞;
(2)通过免疫分选去除单个核细胞中的CD3+T淋巴细胞;
(3)加入NK细胞培养用无血清细胞培养基及终浓度为10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/ml IL-21、10-500ng/ml IL-18和500-2000U/ml IL-2接种在细胞培养瓶体外培养2-5天后全换液,待细胞生长状态良好。
6.根据权利要求3所述细胞组合物在癌细胞NCI-H1975上的应用,其特征在于:γδT细胞和NK细胞混合细胞物共培养包括如下步骤:
(1)取单独培养中生长状态良好的γδT细胞适量,并放置于培养瓶中;
(2)取单独培养中生长状态良好的NK细胞适量,并放置于上述步骤(1)γδT细胞培养瓶中;
(3)向培养瓶中加入自体血清的RMPI 1640和X-vivo15培养基1-2天;
(4)2-3天向细胞培养瓶中加入10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/mlIL-21、10-500ng/ml IL-18和500-2000U/ml IL-2的混合培养基进行半量换液,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;
(5)培养第5天-第18天,每天观察细胞生长状态,补加含细胞因子的自体血清的RMPI1640和X-vivo15培养基,维持细胞浓度1×106cells/ml,置于饱和湿度、37℃、5.0%CO2培养箱继续培养,至达到所需细胞数量时收获细胞;如果细胞体积超过240ml,则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养,14-18天收获混合细胞培养物。
7.根据权利要求4-6任一项所述细胞组合物在癌细胞NCI-H1975上的应用,其特征在于:RMPI 1640和X-vivo15的比例为1:0.5-5。
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