[发明专利]一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质交联的方法

权利要求书

1.一种用于实现蛋白质交联的肽链标签，其由氨基酸序列如Sequence No.2所示的肽链和氨基酸序列如Sequence No.3所示的肽链组成一组，或者由氨基酸序列如SequenceNo.3所示的肽链和氨基酸序列如Sequence No.4所示的肽链组成一组；在所述肽链中，赖氨酸和/或谷氨酰胺的位点靠近N端；带有该肽链标签的蛋白能够利用谷氨酰胺转氨酶（TGase）实现蛋白质有序交联。

2.一种编码如权利要求1所述的肽链标签的核酸，其由脱氧核糖核苷酸序列如Sequence No.6所示的肽链和脱氧核糖核苷酸序列如Sequence No.7所示的肽链组成一组，或者由脱氧核糖核苷酸序列如Sequence No.7所示的肽链和脱氧核糖核苷酸序列如Sequence No.8所示的肽链组成一组。

3.一种实现蛋白质交联的方法，其包括：

步骤L，将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白质基因片段5’端，获得带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段；

步骤M，表达带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，获得带有肽链标签的蛋白质；

步骤N，在谷氨酰胺转氨酶（TGase）存在条件下对带有肽链标签的蛋白质进行交联制得交联蛋白；

其中，所述肽链标签为如权利要求1所述的肽链标签或由权利要求2所述的核酸编码的肽链标签。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤N中，将谷氨酰胺转氨酶加入到含带有肽链标签的蛋白质的底物溶液中，进行交联反应，制得交联蛋白；以底物溶液的体积计谷氨酰胺转氨酶的使用量为1wt%-3wt%；和/或，所述底物溶液由含带有肽链标签的蛋白质溶于缓冲溶液中形成，以底物溶液体积计含带有肽链标签的蛋白质的含量为5-10mg/mL；所述缓冲溶液为0.05mol/L的Tris-HCl溶液；在步骤N中，所述交联的温度为20-30℃；和/或，交联时间为4-12小时。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤M包括：

步骤B，将带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质的基因片段连接到载体上构建重组表达载体；

步骤C，重组表达载体转入宿主细胞，获得表达菌株；

步骤D，将表达菌株进行发酵培养，并以诱导剂进行诱导表达，然后将菌体破胞后重新悬浮，离心，收集上清液进行分离纯化，获得带有肽链标签的蛋白质纯品。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤M包括：

步骤B，将带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质的基因片段连接到载体上构建重组表达载体；

步骤C，重组表达载体转入宿主细胞，获得表达菌株；

步骤D，将表达菌株进行发酵培养，并以诱导剂进行诱导表达，然后将菌体破胞后重新悬浮，离心，收集上清液进行分离纯化，获得带有肽链标签的蛋白质纯品。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌，；和/或，所述载体为pET32b(+)载体；和/或，所述诱导剂为IPTG。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）；和/或，所述IPTG的加入量为发酵液体积的0.05%。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌；和/或，所述载体为pET32b(+)载体；和/或，所述诱导剂为IPTG。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）；和/或，所述IPTG的加入量为发酵液体积的0.05%。

11.根据权利要求5-10中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤D中，将表达菌株接入培养基中进行发酵培养，然后加入诱导剂进行诱导表达培养；所述培养基为LB培养基或TB培养基；和/或，发酵培养的温度为37℃。