[发明专利]一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质交联的方法

说明书

本发明涉及一种用于实现蛋白质交联的肽链标签，其肽链长度为8至15个氨基酸，肽链中至少带有一个赖氨酸和/或谷氨酰胺，其氨基酸序列包括Sequence No.1‑4中的至少一种。本发明还涉及一种实现蛋白质交联的方法，该方法将带有赖氨酸或谷氨酰胺这两个指定氨基酸的肽链基因插入蛋白质的N端，通过大肠杆菌表达相应的蛋白质。利用谷氨酰胺转氨酶(TGase)对赖氨酸的伯胺基团和谷氨酰胺的酰胺基团有特异性识别交联的功能，实现蛋白质之间的有序交联同时能保证蛋白质的活性无明显损失，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质交联的方法，具体地涉及一种用于实现蛋白质交联的肽链标签以及基于该肽链标签实现蛋白质交联的方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(TGase)，最早是由Clarke等人在豚鼠的肝脏中发现的，随后又在动植物、鱼类、微生物中发现。谷氨酰胺转氨酶(TGase)可催化蛋白质或多肽的谷氨酰胺残基和伯胺基团之间发生酰基转移反应。随着微生物产谷氨酰胺转氨酶(TGase)技术的成熟和商业化生产，谷氨酰胺转氨酶(TGase)被应用到越来越多的领域当中，如食品领域(肉类、奶类、豆类等食品加工)、生物医药领域(药物载体、医学支架)、材料领域等。谷氨酰胺转氨酶(TGase)近来在修饰蛋白质和酶的功能性方面引起了很多关注。Noriho Kamiya通过使用谷氨酰胺转氨酶交联脂肪酶粗酶液，证明除了根霉脂肪酶粗酶液外，其余脂肪酶无法交联，而将根霉脂肪用镍柱纯化后发现纯酶无法被交联。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种利用谷氨酰胺转氨酶实现蛋白质有序交联同时能保证蛋白质的活性无明显损失的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种带有特定氨基酸的肽链标签，将该肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白基因经表达后所获得的带有该肽链标签的蛋白能够利用谷氨酰胺转氨酶实现蛋白质交联。本发明还提供了一种利用谷氨酰胺转氨酶实现蛋白质交联的方法，该方法将上述带有特定氨基酸的肽链标签的基因插入蛋白基因进行表达培养，所获得的带有该肽链标签的蛋白利用谷氨酰胺转氨酶实现蛋白质有序交联，同时能保证蛋白质的活性无明显损失。

为此，本发明第一方面提供了一种用于实现蛋白质交联的肽链标签，其肽链长度为8至15个氨基酸，肽链中至少带有一个赖氨酸和/或谷氨酰胺，其氨基酸序列包括Sequence No.1-4中的至少一种。

根据本发明，在所述肽链中，赖氨酸和/或谷氨酰胺的位点靠近N端。

在本发明的一些实施例中，所述肽链的脱氧核糖核苷酸序列包括Sequence No.5-8中的至少一种。

本发明第二方面提供了一种实现蛋白质交联的方法，其包括：

步骤L，将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白质基因片段5’端，获得带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段；

步骤M，表达带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，获得带有肽链标签的蛋白质；

步骤N，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质进行交联制得交联蛋白；

其中，所述肽链标签为如权利要求1-3中任意一项所述的肽链标签。

根据本发明，在步骤N中，将谷氨酰胺转氨酶加入到含带有肽链标签的蛋白质的底物溶液中，混合后进行交联反应，制得交联蛋白。

在本发明的一些实施例中，以底物溶液的体积计谷氨酰胺转氨酶的使用量为1wt％-3wt％。

本发明中，所述底物溶液由含带有肽链标签的蛋白质溶于缓冲溶液中形成。

在本发明的一些实施例中，以底物溶液总体积计带有肽链标签的蛋白质的含量为5-10mg/mL。