[发明专利]一种高效生产重组人血清白蛋白的发酵方法

说明书

本发明涉及一种高效生产重组人血清白蛋白的发酵方法，采用巴斯德毕赤酵母菌作为生产菌株，通过对其生长期和诱导期的温度、pH、溶氧水平、甲醇浓度、培养基成分等各方面条件的优化，大幅度提高了宿主细胞目的蛋白重组人血清白蛋白(rHSA)的表达量，同时避免了发酵液中含有过多的酵母细胞碎片，利于下游纯化过程。经过优化，发酵培养基和诱导培养基成分较现有培养基成分简单，可以有效降低经济成本。本发明有效的缩短了诱导期，整个发酵过程仅需要经过92‑116h，便可以获得表达量为25.3g/L的重组人血清白蛋白，相比于现有技术具有更高的生产效率，能够满足庞大的市场需求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效生产重组人血清白蛋白的发酵方法。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)在近几十年的临床治疗中发挥了各种各样的作用。目前，HSA的生产工艺以人体血浆为原材料，以低温乙醇沉淀法为主要生产手段。但人体血浆自身的供应缺口、极其复杂的血浆来源以及血液病毒经药传播的风险，都严重限制了HSA的产业化生产。

经过数年，科研人员成功的使用多种表达系统实现了重组人血清白蛋白(rHSA)的表达。相比其他表达系统而言，HSA在毕赤酵母中的表达量较高，生产成本较低，后期的分离纯化工艺也较为成熟，故成为最有希望实现药用HSA产业化和商品。研究表明，外源蛋白在毕赤酵母表达系统内的表达量受到一系列因素的影响，如上游的外源基因本身特性和菌种特性，以及下游的培养环境因素、辅助表达物的添加以及包括补料方式在内的发酵工艺等。但是相关研究均存在一个共同的难题，即甲醇的诱导时间过长(普遍超过200个小时)，直接导致rHSA生产效率的低下。如专利CN200510068171发酵生产重组人血清白蛋白HSA的方法中需要360个小时才能完成整个发酵流程，获得重组人血清白蛋白。现阶段我们亟需提高发酵生产效率，以满足庞大的市场需求。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种高效生产重组人血清白蛋白的发酵方法，采用巴斯德毕赤酵母菌作为生产菌株，通过对其生长期和诱导期的温度、pH、溶氧水平、甲醇浓度、培养基成分等各方面条件的优化，大幅度提高了宿主细胞目的蛋白HSA的表达量。

本发明所采用的技术方案为：

(1)取rHSA GS115工程菌液，转接于900-1000倍菌液体积的第一YPD培养基上震荡培养16-18h，得到一级菌液，将所述一级菌液继续转接于900-1000倍菌液体积的第二YPD培养基上震荡培养16-18h，得到种子液备用；

(2)向种子液中加入为其体积为4-6倍的发酵培养基中进行发酵，温度为27-29℃，pH为5.5-6.0，转速设定为200-800rpm，溶氧水平保持在19％-21％，得到发酵液；

(5)当溶氧水平大幅上升时，向发酵液中连续流加浓度为8-12g/L的甘油补料液，得到补料后发酵液；

(6)当溶氧水平再次大幅上升时，连续流加甲醇诱导液和辅助诱导剂进行诱导，甲醇的浓度保持在8-12ml/L，调节pH为5.9-6.1，温度为20-23℃，诱导60-80h后得到诱导后发酵液；

(5)将所述诱导后发酵液离心、分装后冷冻保存，即得含有重组人血清白蛋白的发酵液。

进一步的，步骤(1)中，所述第一YPD培养基和第二YPD培养基的配制方法为：取胰蛋白胨20g、酵母提取物10g，溶于去离子水并定容至900mL，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，待冷却后于无菌超净工作台内加入200g/L的葡萄糖100mL。

进一步的，步骤(1)中，所述培养温度为28-31℃。

进一步的，步骤(2)中，所述发酵培养基含有23-35g/L的酵母提取物和8-12g/L的甘油。