[发明专利]一种猪瘟抗体阻断检测试纸

权利要求书

1.一种猪瘟抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，其特征在于，抗原垫吸附猪瘟病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“|”和质控线C“|”印迹，检测线T为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb2或抗猪瘟病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。

2.根据权利要求1所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述试纸以单克隆抗体阻断模式检测猪瘟中和抗体，在检测膜显现两条红色条带“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，则为猪瘟抗体阴性；显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，则为猪瘟抗体弱阳性；只显现一条红色条带“|”，则为猪瘟抗体强阳性。

3.根据权利要求1所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1具有病毒中和VN活性，特异识别E2蛋白中和抗原表位；单克隆抗体mAb2特异识别E2蛋白非中和抗原表位；猪瘟病毒检测抗原为猪瘟病毒抗原，E2重组蛋白或多肽抗原。

4.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1和mAb2的制备方法为：

(1)猪瘟病毒免疫抗原的制备

以猪瘟病毒标准强毒株石门株接种猪肾细胞PK-15，48～60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量达10^-7以上，荧光定量PCR测定纯化病毒拷贝数达10¹⁰以上；

(2)抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备

(2.1)杂交瘤细胞株的建立

将猪瘟病毒免疫抗原免疫小鼠，建立抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株；

(2.2)单克隆抗体的制备

(2.3)单克隆抗体的鉴定

(2.3.1)单克隆抗体的抗体效价

以酶联免疫吸附试验和免疫过氧化物酶单层细胞试验测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价，单抗上清和腹水的ELISA效价分别在1:400和1:10⁵以上，IPMA效价分别在1:40和1:4000以上；

(2.3.2)识别病毒蛋白

以Western blot检测单克隆抗体识别猪瘟病毒病毒蛋白；

(2.3.3)单克隆抗体亚型鉴定

利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定猪瘟病毒单克隆抗体的免疫球蛋白亚型；

(2.3.4)病毒中和(VN)活性

以病毒中和试验测定单克隆抗体腹水对猪瘟病毒的中和活性，筛选获得具有病毒中和活性的单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb1，用于胶体金标记；

(2.3.5)单克隆抗体识别抗原表位分析

以叠加ELISA对CSFV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析鉴定，以与单克隆抗体mAb1识别不同抗原表位的单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb2，用于检测线T印迹；

(2.4)单克隆抗体的纯化

以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。

5.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，猪瘟病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的猪瘟病毒培养物。

6.根据权利要求5所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，猪瘟病毒抗原的具体制备方法为：以猪瘟病毒疫苗毒株HCLV接种猪睾丸细胞ST，48-60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量TCID₅₀达10^-7以上；分别在CSFV培养物中加入终浓度为0.1％～0.5％的甲醛溶液或0.02％～0.2％的β-丙内酯，充分混匀，分别置4℃灭活48h或37℃灭活9h，制备CSFV灭活病毒抗原。