[发明专利]用于聚合酶链式反应(PCR)的新型组合物、方法和试剂盒

权利要求书

1.一种组合物，其包含：

a)核酸聚合酶；

b)第一热启动机制；和

c)第二热启动机制；

其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制不同，并且二者一起能够在第一温度实质性抑制所述核酸聚合酶的活性而在第二温度不实质性抑制所述核酸聚合酶的活性。

2.权利要求1的组合物，其中所述核酸聚合酶为DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。

3.权利要求1的组合物，其中所述核酸聚合酶为热稳定性的。

4.权利要求1的组合物，其中所述核酸聚合酶选自Taq DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、TfiDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent^TMDNA聚合酶。

5.权利要求1的组合物，其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制选自包括以下的机制：

a)抗体或抗体的组合；

b)寡核苷酸；

c)化学修饰；

d)氨基酸修饰；

e)融合蛋白；和

f)温度依赖性配体。

6.权利要求5的组合物，其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制是温度敏感性的。

7.权利要求6的组合物，其中所述第一热启动机制包括在较低温度阻断DNA聚合酶活性的抗体或抗体的组合。

8.权利要求7的组合物，其中所述第二热启动机制选自在较低温度阻断聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的核酸聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的核酸聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定核酸结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白和抑制聚合酶活性的温度依赖性配体。

9.权利要求1的组合物，其中所述第一温度低于40℃，所述第二温度高于40℃。

10.权利要求1的组合物，其中所述第一和/或第二热启动机制是可逆的。

11.一种用于扩增靶核酸的方法，其包括：

a)在第一温度将靶核酸与核酸聚合酶、双重热启动反应混合物、至少一种引物和至少一种dNTP接触，从而形成反应组合物，所述双重热启动反应混合物包含第一热启动机制和第二热启动机制，其中所述第一热启动机制包含特异于所述聚合酶的抗体或抗体的组合，其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制不同，并且二者一起能够在第一温度实质性抑制所述核酸聚合酶的活性而在第二温度不实质性抑制所述核酸聚合酶的活性：

b)将所述反应组合物加热至第二温度；和

c)扩增反应组合物中的靶核酸。

12.权利要求11的方法，其中所述核酸聚合酶是热稳定性的。

13.权利要求11的方法，其中所述核酸聚合酶为DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。

14.权利要求11的方法，其中所述核酸聚合酶选自Taq DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、TfiDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent^TMDNA聚合酶。

15.权利要求14的方法，其中所述第二热启动机制是温度敏感性的。

16.权利要求11的方法，其中，与仅具有单一热启动机制的反应混合物相比，所述双重热启动反应混合物在扩增步骤中降低非特异性产物形成约2-4倍。