[发明专利]用于聚合酶链式反应(PCR)的新型组合物、方法和试剂盒

说明书

本公开涉及用于聚合酶链式反应(PCR)的新型组合物、方法和试剂盒。具体而言，本公开内容涉及用于使用双重热启动反应混合物扩增靶核酸同时减少非特异性扩增和非期望的扩增产物的组合物、方法和试剂盒，所述双重热启动反应混合物包含至少两个不同的热启动机制。

本申请是申请日为2013年6月14日、申请号为201380039516.0、 发明名称为“用于聚合酶链式反应(PCR)的新型组合物、方法和试剂盒” 的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本公开内容总地来说涉及用于扩增核酸同时减少非特异性扩增和/ 或非期望的扩增产物的组合物、方法和试剂盒。

背景技术

虽然聚合酶链式反应(PCR)和相关技术对于各种应用是高度有用 的，但因非期望的副反应而产生的非靶核酸的扩增可呈现严重问题。这 样的副反应可因非靶核酸的错误引发(mis-priming)和/或引物寡聚化(有 时称为引物-二聚体形成)和这些引物引发假象的后续扩增而发生。这在其 中使用具有显著背景核酸而靶核酸以低拷贝数存在的核酸混合物来进行 PCR的应用中尤其如此(参见，例如，Chou等人,Nucl.Acids Res. 20:1717(1992))。非特异性扩增产物的产生至少部分归因于DNA聚合酶 在环境温度延伸非特异性退火的引物的活性(参见，例如，Chou等人,同 上；Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4580(1990))。因此，抑制DNA 聚合酶在室温的活性在控制次级扩增子的产生中是有益的。

已描述了几个据报导减少非期望的第二扩增产物形成的“热启动” 技术。根据某些“手工热启动”技术，在混合物的温度未高至足以阻止非 特异性引物退火之前，不向反应混合物中添加对于DNA聚合酶活性至关 重要的组分(例如，二价离子和/或DNA聚合酶本身)(参见，例如，Chou 等人,同上；D’Aquila等人,Nucl.Acids Res.19:3749(1991))。较不劳动密集型的技术使用扩增反应的至少一种组分的物理隔离或可逆失活。例 如，可将镁或DNA聚合酶隔离在石蜡珠粒中，随着反应温度升高所述石 蜡珠粒熔化，从而仅在升高的温度释放隔离的组分。根据其它技术，例 如通过DNA聚合酶的可逆化学修饰、抗体对DNA聚合酶的结合或结合 DNA聚合酶的寡核苷酸分子来可逆地使DNA聚合酶失活或修饰其(参 见，例如，美国专利No.5,677,152和5,338,671；和Dang等人,J.Mol.Biol. 264:268(1996))。在升高的反应温度下，化学修饰被逆转，或抗体分子或 寡核苷酸分子被变性，从而释放功能性DNA聚合酶。然而，这些技术中 的一些技术似乎不是最佳的，因为可在较低反应温度检测到一定的DNA 聚合酶活性(尽管进行了失活)，或它们需要反应混合物在高温的持久暴 露，以完全活化DNA聚合酶，这可导致反应混合物的一些组分永久性失 活。