[发明专利]一种枯草芽孢杆菌振荡型基因表达系统及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种振荡基因表达调控质粒pOSC，其特征在于，该振荡基因表达调控质粒pOSC是在载体pHT01上并联分别由启动子Ptet及启动子PsrfA启动的两条代谢调控通路得到的；

该振荡基因表达调控质粒pOSC的构建方法包括以下步骤：

（1）以枯草芽孢杆菌Bacillus substilis 168基因组DNA为模板，利用引物PsrfAFor，PsrfARev扩增srfA基因上游启动子序列；

（2）以大肠杆菌DH10B基因组DNA为模板，利用引物tetRFor，tetRRev扩增tetR基因片段；

（3）NheI/XbaI双酶切质粒pHT43，回收纯化5.4 Kb载体片段；

（4）通过Gibson assembly将步骤（1）与步骤（2）中纯化回收的启动子PsrfA片段，tetR基因片段连接到步骤(3)纯化回收的质粒载体，即获得质粒pHT43-PsrfA-tetR；tetR基因下游预留有一个BamH1酶切位点，方便后续靶基因的插入；

（5）合成ssrA-comA-Ptet基因元件，两端各融合了20bp pHT43-PsrfA-tetR载体EcoRV位点两侧的同原序列；

（6）EcoRV单酶切质粒pHT43-PsrfA-tetR，回收纯化7.5 Kb载体片段；

（7）通过Gibson assembly将步骤（5）中的基因片段连接到步骤(6)单酶切线性化的质粒载体，即获得质粒pOSC；

所述引物和基因序列如下：

PsrfAFor: 5’- gccagtcactatggcgtgctgatatcgacaaaaatgtcatg-3’

PsrfARev: 5’-cttttatctaatctagacatattgtcatacctcccctaatc-3’

tetRFor: 5’-gattaggggaggtatgacaatatgtctagattagataaaag-3’

tetRRev: 5’- ctgccccggggacgtcgactttaagacccactttcacat-3’

ssrA-comA-Ptet：

cagtcactatggcgtgctgaTGCTGCTAATGCTACATTTTGATTAAATGAATTTGTTTTTCCTGCttaggcagctaatgctacgttttggttaaaactgttagttttgccaagtacaccgtctgatttcgcaatcaaaaccgcttccgtccgtgaaccgacattcagcttattgaaaatcgatgtcaagctgtattcaatggaccgcttgcttaaatgaagggcatctgcgatttcttggtttgtaaatcccttttcaacttcttgaagaatcaggcattctctaggtgtgagcacatcttgttctttttgagaggaaggagccggctttgttttttgctgagtcatcagctgtttaaagtaagcaaaatcgactaaaatttctccgttgagtacgtggtatatgtattgggtgatcttttctttagattccgttttgctgatggcaccgtgcagacccgcacgaatcgcttcctcgaaataatcctcgacctcataaccggtatacacgataattttacaatgaggattctcttgtaaaatctgtttagaaagctccatcccattgacctcgccgcctagattcagatccattaaaatgagatcatatgacgagaaatcatgctgcttgataaactgttcgctcggttcaggactgagacaatcaacagacaaattcgaatccgtttccaaaattgtcttggtgccttccatgacagccggatggtcatcaatcactagtatctttttcatacccatctctttatccttacctattgtttgtcgctagcgtcgaatgcaagcagcagtatctctatcactgatagggatgtcaaagcAtcgacaaaaatgtcatgaaag。