[发明专利]一种枯草芽孢杆菌振荡型基因表达系统及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌振荡型基因表达系统及其构建方法与应用，属于生物技术领域。该枯草芽孢杆菌振荡型基因表达系统是在枯草芽孢杆菌基因组上敲除应答调节因子基因comA，转入振荡基因表达调控质粒pOSC得到的。通过调控基因表达的周期性开关过程，振荡型基因表达系统可以缓解稳定生长期代谢底物及能量的供给压力，使基因表达与底物供给达到平衡，进而提高表达产量。利用该系统表达透明质酸合成相关基因，成功构建了高产透明质酸的重组枯草芽孢杆菌。

技术领域：

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌振荡型基因表达系统及其构建方法与应用，具体涉及枯草芽孢杆菌细胞内由comA/PsrfA及tetR/Ptet元件调控的基因周期性开关的构建过程，属于生物技术领域。

背景技术：

随着分子生物学，微生物学等学科的发展，多种原核及真核生物表达系统被开发，用以生产重组蛋白。其中枯草芽孢杆菌作为一种重要的革兰氏阳性模式菌株，具有非致病性、遗传背景清晰、容易分离培养、分泌蛋白能力强等特性，是异源蛋白表达和分泌的理想宿主。迄今为止，已经有大量的原核和真核基因在枯草芽孢杆菌细胞内克隆和表达，其中部分已应用于工业化生产。合理利用基因重组技术，优化枯草芽孢杆菌代谢途径，提高目标蛋白的产量具有重要的产业化应用价值。

高效可控的启动子是保证工业上枯草芽孢杆菌高效表达外源蛋白的关键因素之一。周哲敏等通过启动子PsrfA开发构建了枯草芽孢杆菌内的自诱导基因表达系统，在指数生长期启动子活性较低，在稳定生长期显示出强启动子活性。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种广泛存在于脊椎动物体内的高分子酸性粘多糖，由D-葡萄糖醛酸(D-glucuroic acid,GlcA)和N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)通过β—1,3和β—1,4糖苷键交替连接而成。由于其独特的理化特性，包括良好的保湿性，渗透性，延展性，无任何免疫原性及毒性，透明质酸在化妆品，食品，医疗等领域应用广泛。

透明质酸广泛存在于动物组织细胞间质中，其中以眼玻璃体，鸡冠，脐带，关节滑液含量较高。20世纪80年代前，透明质酸主要通过鸡冠提取，原料来源有限，产量很低。且提取的透明质酸常混有杂蛋白及硫酸软骨素等粘多糖，致使收率低，提纯难，难以应用于大规模生产。上世纪70年代以来，我国开始用微生物发酵法产透明质酸。常用微生物包括兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等。透明质酸发酵对安全性的需求限制了链球菌的发酵应用，并且链球菌对营养要求高，培养基原料成本高。因此，开发一种安全经济，营养要求低，产量高的基因工程菌已经成为迫切需要解决的问题。

本发明通过将透明质酸表达途径相关基因转入枯草芽孢杆菌，置于振荡型基因表达系统靶基因位点，实现了透明质酸在食品级微生物枯草芽孢杆菌中的高效生物合成。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种振荡基因表达调控质粒pOSC及其构建方法。

本发明的另一目的在于提供一种枯草芽孢杆菌振荡型基因表达系统及其构建方法。

本发明的又一目的在于提供上述枯草芽孢杆菌振荡型基因表达系统在重组蛋白表达中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种应用枯草芽孢杆菌振荡型基因表达系统生产透明质酸的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种振荡基因表达调控质粒pOSC，该振荡基因表达调控质粒pOSC是在载体pHT01上并联分别由启动子Ptet及启动子PsrfA启动的两条代谢调控通路得到的。

优选的，所述的启动子Ptet启动的代谢调控通路包含启动子Ptet、应答调节因子基因comA和蛋白降解标签基因ssrA；所述的启动子PsrfA启动的代谢调控通路包含启动子PsrfA、阻遏基因tetR和靶基因T。

上述的振荡基因表达调控质粒pOSC的构建方法，包括以下步骤：