[发明专利]基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法在审
| 申请号： | 201910413839.0 | 申请日： | 2019-05-17 |
| 公开（公告）号： | CN111944848A | 公开（公告）日： | 2020-11-17 |
| 发明（设计）人： | 王甜 | 申请（专利权）人： | 杭州普科亭生物医药有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/864 | 分类号： | C12N15/864;C12N5/10 |
| 代理公司： | 杭州华知专利事务所(普通合伙) 33235 | 代理人： | 张德宝 |
| 地址： | 310052 浙江省杭州市滨江区长河街道滨*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 技术 crispr cas9 提高 基因 定点 整合 细胞 方法 | ||
1.一种基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、针对某个特异性的肿瘤抗原，设计合成目的基因，并在目的基因两侧合成同源臂；
步骤2、将步骤1中合成的目的基因及同源臂构建到腺相关病毒载体上，并产病毒；
步骤3、合成识别插入位点的guide RNA，表达纯化Cas9蛋白；
步骤4、将步骤3中的guide RNA和Cas9蛋白体外结合后，再与细胞混合，电转；
步骤5、细胞电转后，将带有目的基因的腺相关病毒加入到电转后的细胞中，以将目的基因定点整合到细胞中；
步骤6、检测目的基因的表达情况以及细胞的功能。
2.根据权利要求1所述的基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，其特征在于，步骤1目的基因为CAR基因，步骤3中插入位点为TCR位点，步骤4中细胞为人原代T细胞。
3.根据权利要求1或2所述的基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，其特征在于，步骤1中同源臂大小为300-800bp。
4.根据权利要求1或2所述的基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，其特征在于，步骤4中guide RNA和Cas9蛋白在体外室温或37℃结合10-20min。
5.根据权利要求1或2所述的基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，其特征在于，步骤4中采用CeletrixTM电转系统电转。
6.根据权利要求1或2所述的基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，其特征在于，步骤6采用流式细胞术检测目的基因的表达情况，并检测细胞的功能。
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