[发明专利]基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法

说明书

本发明公开一种基于电转技术和CRISPR‑Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，包括：针对某个特异性的肿瘤抗原，设计合成目的基因，并在目的基因两侧合成同源臂；将合成的目的基因及同源臂构建到腺相关病毒载体上，产病毒；合成识别插入位点的guide RNA，表达纯化Cas9蛋白；将guide RNA和Cas9蛋白体外结合后，再与细胞混合，电转，后加入带有目的基因的腺相关病毒，检测目的基因的表达情况以及细胞的功能。本发明是基于电转技术和CRISPR‑Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，并通过腺相关病毒作为插入基因的载体，可以实现高效率的定点插入效果。

技术领域

本发明涉及基因的定点插入，具体是利用电转技术结合CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，用于白血病的治疗。

背景技术

目前实现将基因整合到细胞中的方法主要是通过传统的慢病毒和逆转录病毒，但是该方法的插入是随机插入，如果能够将外源基因定点插入到细胞中达到治疗疾病的目的，会在临床上发挥更大的作用。CRISPR-Cas9系统在实现对基因敲除方面取得了很大成就，但是对于基因的定点插入比例仍然很低，不管是稳定的细胞系还是原代细胞。

若能通过改造CRISPR-Cas9技术将目的基因定点插入细胞中，从而实现目的基因在细胞上的定点整合，尤其是如果能将识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)整合到T细胞中，将会极大地提高CAR-T疗法的有效性和安全性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，以解决现有技术的不足。

本发明采用以下技术方案：

一种基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，包括如下步骤：

步骤1、针对某个特异性的肿瘤抗原，设计合成目的基因，并在目的基因两侧合成同源臂；

步骤2、将步骤1中合成的目的基因及同源臂构建到腺相关病毒载体上，并产病毒；

步骤3、合成识别插入位点的guide RNA，表达纯化Cas9蛋白；

步骤4、将步骤3中的guide RNA和Cas9蛋白体外结合后，再与细胞混合，电转；

步骤5、细胞电转后，将带有目的基因的腺相关病毒加入到电转后的细胞中，以将目的基因定点整合到细胞中；

步骤6、检测目的基因的表达情况以及细胞的功能。

进一步地，步骤1目的基因为CAR基因，步骤3中插入位点为TCR位点，步骤4中细胞为人原代T细胞。

进一步地，步骤1中同源臂大小为300-800bp。

进一步地，步骤4中guide RNA和Cas9蛋白在体外室温或37℃结合10-20min。

进一步地，步骤4中采用CeletrixTM电转系统电转。

进一步地，步骤6采用流式细胞术检测目的基因的表达情况，并检测细胞的功能。

本发明的有益效果：

本发明是基于电转技术和CRISPR-Cas9技术提高基因定点整合到细胞的方法，并通过腺相关病毒作为插入基因的载体，可以实现高效率的定点插入效果。

本发明能够实现将目的基因CAR定点整合到人原代T细胞的TCR上，极大地提高了CAR-T细胞定点插入的比例，该技术的开发比传统的依赖于慢病毒和逆转录病毒插入CAR基因的效果更佳。

附图说明

图1为实施例1CAR基因结构示意图。