[发明专利]一种克氏原螯虾C型凝集素gLecB基因及其编码的gLecB蛋白

权利要求书

1.一种克氏原螯虾C型凝集素gLecB基因，其特征在于，所述克氏原螯虾C型凝集素gLecB基因的序列为SEQ ID NO：1。

2.一种利用权利要求1所述氏原螯虾C型凝集素gLecB基因编码的gLecB 蛋白，其特征在于，所述gLecB 蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3.一种表达权利要求2所述gLecB 蛋白的载体，其特征在于，所述载体为pGEX-5X-1-B-Lectin；

所述载体的构建方法，包括：

第一步， RNA提取及反转录：

选取三只克氏原螯虾，抽血解剖取组织样: 血淋巴、心、肝、鳃、胃、肠，采用TRIzol法取总RNA；Nano-Drop 300检测RNA纯度及浓度，经琼脂糖凝胶电泳检测通过Bio-Rad凝胶成像仪分析总RNA质量；根据反转录说明书操作步骤反转录合成cDNA；

第二步，gLecB全长编码区基因扩增：

设计用于序列扩增的专一性引物，上游引物gLecB-EcoR I：5‘（TACTCAGAATTCGCCAAATCCACGTGC）3’，下游引物Pc-B-Lectin-Xho I：5‘（TACTCACTCGAGTTACTGTGCTTGCTTGGG）3’ ；扩增片段长度为942bp；以反转录得到的cDNA为模板作PCR扩增；建立25μL PCR反应体系，反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，54℃退火20s，72℃延伸40s，35次循环后72℃延伸8 min；扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收试剂盒回收942bp的PCR产物；PCR扩增产物经胶回收纯化得到目的片段；

第三步， pGEX-5X-1-B-Lectin表达载体的构建：

将pGEX-5X-1载体和胶回收后的gLecB PCR产物分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，电泳检测并分别胶回收纯化，然后用T4 DNA连接酶将其于恒温水浴锅16℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌 DH5α，37℃培养2h，在含 100 μg/mL 的氨苄青霉素(Amp)的 LB 培养基上生长，挑取单菌落以 primer-B-Lectin引物作PCR鉴定，阳性克隆按1％比例扩大培养，扩增后提取质粒，最后送公司测序验证。