[发明专利]针对AP25的ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，包括：AP25标准品、偶联抗原、包被液、封闭液、洗液、AP25单克隆抗体、酶标二抗、PBS缓冲液、显色液和终止液，所述偶联抗原的制备方法为：先将AP25与BSA溶液混合，加入戊二醛，涡旋混合反应后加入甘氨酸和非离子型表面活性剂，再次涡旋混合反应，即得到偶联抗原。

2.如权利要求1所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述偶联抗原的制备方法为：

将0.5ml浓度为5mg/ml的AP25与0.5ml蛋白浓度为2.5mg/ml的BSA溶液混匀，得到反应体系；所述BSA溶液是指以PBS缓冲液为溶剂制备的BSA溶液；

取4℃避光保存的质量浓度为20％的戊二醛50ul，补加去离子水至5ml，混匀得到戊二醛溶液，取150ul戊二醛溶液缓慢滴加至前述反应体系中，置于涡旋混匀器上，避光，以100r/min的速度旋转混合反应3h，加入16ul浓度为1M的甘氨酸溶液以及5μl非离子型表面活性剂，再次旋转混合反应40min，得到偶联抗原AP25-BSA。

3.如权利要求1所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液的制备方法为：称取8g脱脂奶粉和2g蔗糖，溶解于100mL PBS缓冲液中，混匀，4℃保存备用。

4.如权利要求1所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述PBS缓冲液的制备方法为：称取8.5g NaCl、0.2g KCl、2.85gNa₂HPO4·12H₂O和0.27g KH₂PO4，加入100ml去离子水，调节pH至7.2，即得。

5.如权利要求2所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被液的制备方法为：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，去离子水950mL，调节pH值至9.6，加去离子水定容至1000mL，4℃保存。

6.如权利要求5所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗是指HRP标记的山羊抗小鼠IgG，所述显色液为四甲基联苯胺TMB的甲醇溶液。

7.如权利要求6所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗液的制备方法为：将0.5mL TWEEN-20加入1L的PBS缓冲液中，混匀，即得。

8.如权利要求1所述的针对AP25的ELISA试剂盒，其特征在于，所述非离子型表面活性剂选自辛基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或几种。

9.权利要求1-8任一项所述的针对AP25的ELISA试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将偶联抗原用包被液稀释，加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；

S2.去除包被液，洗板，拍干；

S3.每孔加入150μL封闭液，37℃水浴放置1.5h，重复洗板，拍干；

S4.向酶标板中添加AP25标准品或试样，再加入AP25单克隆抗体，于摇床震荡混匀2-5min，再移至37℃水浴放置2-3h，重复洗板，拍干；

S5.每孔加入100μL酶标二抗，37℃温育1h，重复洗板，拍干；

S6.每孔加入100μL显色液，室温避光反应20-30min，每孔加入50μL终止液，终止反应；

S7.采用酶标仪测定各孔在450nm的OD值。

10.如权利要求9所述的针对AP25的ELISA试剂盒的应用，其特征在于，还至少包括以下技术特征之一：

步骤S1中偶联抗原用包被液稀释是指按照体积比1:200-250将偶联抗原与包被液混合；

步骤S4中，加入AP25单克隆抗体前，先用PBS缓冲液稀释，AP25单克隆抗体与PBS缓冲液的稀释体积比为1:2000；

所述洗板的方法为：每孔加入400μL洗液，重复洗涤3次；

所述终止液为浓度3M的硫酸。