[发明专利]针对AP25的ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种针对AP25的ELISA试剂盒及其应用，属于生物医药领域。该试剂盒包括AP25标准品、偶联抗原、包被液、封闭液、洗液、AP25单克隆抗体、酶标二抗、PBS缓冲液、显色液和终止液；利用该试剂盒能快速检测被测样品中的AP25浓度，准确性好、特异性强，操作简单。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种针对AP25的ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

AP25是一种整合素阻断剂，能够显著抑制内皮细胞增殖和迁移，抑制管状结构形成，具有显著的抑制血管生成和抗肿瘤活性。AP25多肽是一组新的氨基酸序列，是一种小分子药物，分子量为1500～3000道尔顿，性状为白色或类白色的块状物或无定形粉末，具备抗肿瘤活性。

AP25的抗肿瘤研究过程中，需进行动物试验，动物给服AP25后，AP25的分布及血浆浓度的测定直接反应的是代谢动力学，为给药方式提供指导。因此，AP25在动物，包括人体中的分布测定方法会影响临床给药方式，建立一种简单、高效的AP25测定方法显得尤为重要。

ELISA-酶联免疫吸附法利用抗原与抗体的特异性反应，以定量测定抗原或者抗体的含量，ELISA的应用非常广，但专门针对AP25的ELISA试剂盒尚未见报道。

发明内容

本申请的目的在于提供一种针对AP25的ELISA试剂盒，该试剂盒包括AP25标准品、偶联抗原、包被液、封闭液、洗液、AP25单克隆抗体、酶标二抗、PBS缓冲液、显色液和终止液，利用该试剂盒能快速检测被测样品中的AP25浓度，准确性好、特异性强，操作简单。

具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本申请提供了一种针对AP25的ELISA试剂盒，包括：AP25标准品、偶联抗原、包被液、封闭液、洗液、AP25单克隆抗体、酶标二抗、PBS缓冲液、显色液和终止液，所述偶联抗原的制备方法为：先将AP25与BSA溶液混合，加入戊二醛，涡旋混合反应后加入甘氨酸和非离子型表面活性剂，再次涡旋混合反应，即得到偶联抗原。

优选地，所述偶联抗原的制备方法为：

将0.5ml浓度为5mg/ml的AP25与0.5ml蛋白浓度为2.5mg/ml的BSA溶液混匀，得到反应体系；所述BSA溶液是指以PBS缓冲液为溶剂制备的BSA溶液；

取4℃避光保存的质量浓度为20％的戊二醛50ul，补加去离子水至5ml，混匀得到戊二醛溶液，取150ul戊二醛溶液缓慢滴加至前述反应体系中，置于涡旋混匀器上，避光，以100r/min的速度旋转混合反应3h，加入16ul浓度为1M的甘氨酸溶液以及5μl非离子型表面活性剂，再次旋转混合反应40min，得到偶联抗原AP25-BSA。

优选地，所述封闭液的制备方法为：称取8g脱脂奶粉和2g蔗糖，溶解于100mL PBS缓冲液中，混匀，4℃保存备用。

优选地，所述PBS缓冲液的制备方法为：称取8.5g NaCl、0.2g KCl、2.85gNa₂HPO4·12H₂O和0.27g KH₂PO4，加入100ml去离子水，调节pH至7.2，即得。

优选地，所述包被液的制备方法为：称取Na₂CO₃1.59 g，NaHCO₃2.93 g，去离子水950mL，调节pH值至9.6，加去离子水定容至1000mL，4℃保存。

优选地，所述酶标二抗是指HRP标记的山羊抗小鼠IgG，所述显色液为四甲基联苯胺TMB的甲醇溶液。

优选地，所述洗液的制备方法为：将0.5mL TWEEN-20加入1L的PBS缓冲液中，混匀，即得。