[发明专利]一种强效抑藻活性物质的提取方法及其应用

说明书

本发明公开了一种强效抑藻活性物质的提取方法及其应用，将抑藻活性菌株接种于液体LB培养基中，培养至对数生长期；将培养至对数生长期的细菌发酵液离心后得到无菌上清液，向无菌上清液中加入乙酸乙酯并将乙酸乙酯与无菌上清液充分混匀萃取，将乙酸乙酯萃取液旋干后得到强效抑藻活性物质，该强效抑藻活性物质用于抑制铜绿微囊藻细胞生长。本发明所提取的抑藻活性物质及其制得的抑藻制剂均能够高效地抑制有害藻类的生长，对水华等灾害的防治及水生生态系统的平衡有重要意义，该抑藻制剂在工业生产中也有巨大的潜力。

技术领域

本发明属于抑藻活性物质的提取及其应用技术领域，具体涉及一种强效抑藻活性物质的提取方法及其应用。

背景技术

淡水藻类过度繁殖会形成水华，水华的爆发往往引起水生环境的改变，破坏了水生系统的生态平衡^[1]。特别是有毒藻引发的水华，其分泌的藻毒素造成了水生生物的死亡，进而产生了巨大的经济问题和健康危机^[2,3]。铜绿微囊藻在水体中繁殖快，生长旺盛，使水体呈灰绿色，形成水华。其浮膜似铜绿色油漆，有臭味，特别是可以产生微囊藻毒素^[4,5]，该毒素能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，诱发肝脏肿瘤，严重威胁水生环境和人类健康^[6]。

在控制有害藻类生长的方法中，常用的有物理法^[6]、化学法^[7]和生物法。物理法主要是通过超声波、紫外线或者活性炭杀死藻细胞，化学法是利用化学药品、絮凝剂等抑制藻类生长，但是这两种方法成本较高，不易操作，危害生态环境及非水华生物^[8]。相对于这两种方法，生物法更加专一、高效，具有生物安全性。近年来，围绕细菌在水华生消过程中的作用，科学家做了大量关于“以菌治藻”的研究^[9-11]。研究表明，细菌可以通过直接或间接的作用抑制藻类的生长，甚至裂解藻细胞，从而表现出抑藻效应。藻菌共培养的研究结果表明抑藻细菌的作用方式可以归结为两种：一是细菌同藻细胞直接接触、导致藻细胞死亡的直接抑藻作用；二是细菌不同藻细胞直接接触，而通过释放某种化学物质导致藻细胞死亡的间接抑藻作用^[13,14]，目前所发现的抑藻细菌多数属于该类，其一般是通过分泌溶解性抑藻物质杀死藻细胞。Li等从抑藻弧菌BS02中分离到一种脂肪酸类物质，能有效的抑制塔玛亚历山大藻的生长^[15]；Wang等发现从厦门海域分离出的溶藻菌DHQ25，可通过分泌胞外蛋白来抑制和杀死有害藻^[16]。

为了有效地控制铜绿微囊藻的生长，我们从不同生境进行抑藻细菌的筛选与分离，从而不断地扩大和丰富抑藻微生物资源。其中本研究所采用的细菌-Exiguobacterium来自于水生环境，目前发现的Exiguobacterium属的细菌绝大多数为革兰氏阳性菌，一般为杆状，也有一些菌种在对数生长期及稳定生长期为球状，具有周生鞭毛，不形成芽孢，是一类兼性厌氧菌。在营养培养基上形成的菌落多为规则圆形，有氧条件下表现为浅黄色，橘黄色等，且色素不扩散，部分菌株在无氧条件下菌落呈乳白。Exiguobacterium属细菌，分布范围广，生存环境多样，具有多种独特的性质，包括耐/嗜冷性、耐/嗜热性、耐/嗜碱性、耐/嗜盐性，并且具有分解复杂有机污染物、转化重金属、促进生长等极具实用价值的功能。但是迄今为止，关于该属的细菌可以分泌抑藻活性物质并应用于有害藻水华治理的报道很少，因此我们是首次对该属菌株分泌的活性物质进行提取、性质鉴定和应用。

国内外研究表明，大多数筛选到的抑藻微生物是通过分泌特异的具有抑藻活性的物质来起抑藻作用的。已经报道的抑藻活性物质包括：蛋白质(含胞外酶)、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物等其他尚未定性的抑藻化合物^[17-22]。通过提取抑藻活性物质成为开发抑藻剂用于水华治理的一个新思路。然而目前国内菌藻关系的研究落后于国外，在抑藻物质的提取、纯化、鉴定等研究方面仍处于起步阶段，已被分离鉴定的抑藻物质还远远不足以满足有害水华的防控。