[发明专利]能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒、CAR-T细胞、构建方法及其应用

权利要求书

1.一种能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：依次连接抗CD30的轻链、抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、抗CD30的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区，并合成基因序列片段；

S2：将步骤S1中得到的基因序列片段连接至慢病毒表达载体PTK881，得到能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒PTK-hCD30-hLMP1。

2.一种利用权利要求1所述的构建方法构建的能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒。

3.一种如权利要求2所述的能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒在制备治疗EB病毒感染的试剂盒或试剂中的应用。

4.一种CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

Sa：利用权利要求1所述的构建方法构建能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒；Sb：慢病毒包装，于37℃含5％CO₂培养箱中用DMEM完全培养基培养293T细胞；将混合有步骤Sa中制备的质粒的三质粒包装系统的DMEM低糖培养基与聚乙烯亚胺混合并摇匀，于37℃孵育；将孵育后的混合液置于37℃含5％CO₂培养箱中培养；收集细胞培养上清液，并经滤膜过滤得到病毒初始液；

Sc：病毒液浓缩，将病毒初始液与5×PEG8000NaCl混合，放置过夜；离心，去除上清，静置，去除残余液体；向离心管内加入PBS缓冲液，溶解慢病毒，得到病毒浓缩液；

Sd：制备T细胞，取健康人的外周新鲜血液，并用PBS缓冲液稀释；将稀释后的血液加入至Ficoll淋巴细胞分离液，并离心，液体分为四层，由下至上依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层；去除血浆层后，将单个核细胞层的液体放入新的离心管中，加入PBS缓冲液，混合均匀后，离心去上清；向残留物中加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，混匀制备成PBMC细胞悬液，并用血细胞计数板计数；调整细胞密度，并加入细胞因子及抗体复合物，置于37℃含5％CO₂培养箱中培养；

Se：慢病毒感染T细胞，向制备好的T细胞中加入病毒浓缩液，并置于含CO₂的培养箱中孵育，进行转导，得到CAR-T细胞。

5.根据权利要求4所述的一种CAR-T细胞的构建方法，其特征在于：步骤Sb中，三质粒包装系统中三种质粒及质量比为PTK-hCD30-hLMP1:GAG:VSVG＝8:6:2。

6.根据权利要求4所述的一种CAR-T细胞的构建方法，其特征在于：步骤Sd中，所述抗体复合物为Anti-CD3(OKT3)及Anti-CD28的复合物。

7.一种利用权利要求4-6任一所述的构建方法构建的CAR-T细胞。

8.一种如权利要求7所述的CAR-T细胞在制备治疗EB病毒感染的试剂盒或试剂中的应用。