[发明专利]能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒、CAR-T细胞、构建方法及其应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒、CAR‑T细胞、构建方法及其应用。该T细胞可同时表达针对霍奇金淋巴癌细胞表面的肿瘤相关抗原LMP1、CD30的抗体Anti‑LMP1、Anti‑30，其技术要点主要包括首先构建能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒，之后对该质粒进行慢病毒包装，并感染T细胞，得到CAR‑T细胞，用该CAR‑T细胞杀灭EB病毒感染的霍奇金淋巴癌细胞。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒、CAR-T细胞、构建方法及其应用。

背景技术

EB病毒是一种全球性分布的双链DNA病毒，被EB病毒感染后，人体自身的免疫系统虽然可以迅速清除被病毒感染的细胞，但是仍有部分EB病毒以潜伏形式终身存在于静息期B细胞中。当机体免疫系统受到抑制时，这些被EB病毒感染的细胞出现增殖，释放EB病毒，被感染的B细胞可能转化为恶性肿瘤细胞，霍奇金淋巴癌便是其中一种。

潜伏膜蛋白1(latent membrane protein1，LMP1)是EB病毒编码的一种唯一确定具有转化能力的蛋白。CD30是肿瘤坏死因子受体超家族(tμmor necrosis factorreceptor sμperfamily，TNFRSF)成员之一，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，高表达于霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)，低表达于非病理状态下活化的T细胞、B细胞表面，而正常细胞不表达。

嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞是一种结合T细胞免疫治疗和抗体靶向治疗的治疗手段，具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力，是一种全新的很有前景的肿瘤免疫治疗策略。

因此，构建同时表达LMP1和CD30双靶点CAR是治疗EB病毒感染导致的霍奇金淋巴癌的有效途径。

发明内容

基于现有技术的缺陷，本发明提供了一种能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒、CAR-T细胞、构建方法及其应用。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒的构建方法，包括以下步骤：

S1：依次连接抗CD30的轻链、抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、抗CD30的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区，并合成基因序列片段；

S2：将步骤S1中得到的基因序列片段连接至慢病毒表达载体PTK881，得到能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒PTK-hCD30-hLMP1。

一种能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒。

一种能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒在制备治疗EB病毒感染的试剂盒或试剂中的应用。

一种CAR-T细胞的构建方法，包括以下步骤：

Sa：利用权利要求1或2任一所述的构建方法构建能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒；

Sb：慢病毒包装，于37℃含5％CO₂培养箱中用DMEM完全培养基培养293T细胞；将混合有步骤Sa中制备的质粒的DMEM低糖培养基与聚乙烯亚胺混合并摇匀，于37℃孵育；将孵育后的混合液置于37℃含5％CO₂培养箱中培养；收集细胞培养上清液，并经滤膜过滤得到病毒初始液；

Sc：病毒液浓缩，将病毒初始液与5×PEG8000NaCl混合，放置过夜；离心，去除上清，静置，去除残余液体；向离心管内加入PBS缓冲液，溶解慢病毒，得到病毒浓缩液；