[发明专利]一种测定重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白生物学活性的新方法

权利要求书

1.一种测定重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白生物学活性的新方法,其特征在于：所述方法利用SIE萤光素酶报告基因质粒，转染CHO-K1细胞后获得稳定表达SIE萤光素酶报告基因的细胞株，利用IL-6/sIL-6α复合物刺激激活 SIE反应元件下游萤光素酶报告基因表达，加入sgp130-Fc后反式信号通路被阻断，抑制萤光素酶报告基因表达；根据测定的萤光信号值拟合四参数曲线确定重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白的生物学活性；

所述方法包括以下步骤：

步骤1，将含SIE萤光素酶的质粒转入细胞，加压筛选，获得稳定表达的单克隆细胞株；

步骤2，将sgp130-Fc融合蛋白药物进行系列稀释，与IL-6/sIL-6Rα复合物37℃孵育1h后，加入至步骤1细胞中，37℃刺激 7h；

步骤3，弃去上述步骤2中的培养液，加入萤光素酶底物测定化学发光值，拟合四参数曲线，根据IC₅₀值确定sgp130-Fc融合蛋白的相对生物学活性；

在上述步骤中参数设定和材料选择如下：

（1）制备细胞悬液采用含10%血清的F12K培养基；

（2）铺板细胞数量为2×10⁴－4×10⁴个/孔；

（3）IL-6浓度为5µg／mL, sIL-6 Rα浓度为2.5µg／mL，sgp130-Fc的预稀释浓度为25000ng/mL,2倍比稀释8个浓度；

（4）sgp130-Fc与IL-6/sIL-6 Rα复合物的预孵育条件为37度0.5-2小时；加入药物刺激时间为5－10小时；

（5）使用萤光素酶底物试剂盒检测化学发光值，使用的试剂盒有promega公司的Bright-G1o、 Biovision公司的luciferase或PerkinElmer公司的 Britelite plus；

（6）使用酶标仪读取化学发光值，通过拟合四参数曲线确定sgp130-Fc融合蛋白和参比品的 IC₅₀ 值，以相对生物学活性：相对生物学活性＝参比品IC₅₀/样品IC₅₀，反映sgp130-Fc融合蛋白的生物学活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中报告基因为luciferase萤光素酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：其中参数设定选择如下：

（2）铺板细胞数量为3×10⁴个／孔。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：其中参数设定选择如下：

（4）sgp130-Fc与IL-6/sIL-6 Rα复合物的预孵育条件为1小时；加入药物刺激时间为7小时。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：其中材料选择如下：

（5）使用萤光素酶底物试剂盒检测化学发光值，使用的试剂盒为promega公司的Bright-G1o。

6.权利要求 1-5 所述任一种方法用于sgp130-Fc融合蛋白药物生产和研发中的质量控制。