[发明专利]一种测定重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白生物学活性的新方法有效

专利信息
申请号: 201910420569.6 申请日: 2019-05-21
公开(公告)号: CN110133241B 公开(公告)日: 2022-05-27
发明(设计)人: 王军志;饶春明;于雷;贾春翠;周勇;姚文荣;史新昌;秦玺;裴德宁 申请(专利权)人: 中国食品药品检定研究院
主分类号: C12N15/85 分类号: C12N15/85;G01N33/50
代理公司: 北京中知法苑知识产权代理有限公司 11226 代理人: 常玉明;张兰海
地址: 100050*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 一种 测定 重组 可溶性 gp130 fc 融合 蛋白 生物学 活性 新方法
【说明书】:

发明涉及一种测定重组人可溶性gp130‑Fc融合蛋白生物学活性的新方法。所述方法利用SIE萤光素酶报告基因质粒,转染CHO‑K1细胞后加压筛选获得稳定表达SIE萤光素酶的单克隆细胞株。利用IL‑6/sIL‑6Rα复合物刺激激活SIE反应元件下游萤光素酶报告基因表达,可溶性gp130‑Fc融合蛋白竞争性结合IL‑6/sIL‑6Rα复合物,剂量依赖性抑制萤光素酶表达,加入萤光素酶底物后,根据测定的化学发光值拟合四参数曲线确定重组人可溶性gp130‑Fc融合蛋白的生物学活性。本发明针对重组人可溶性gp130‑Fc融合蛋白的生物学活性建立了快速准确的检测方法,避免了细胞培养的不确定性所带来的不稳定因素和长时间孵育所带来的细胞污染等可能出现的问题。

技术领域

本发明涉及重组药物生物学活性检测领域,建立了快速、准确的测定重组人可溶性 gp130-Fc融合蛋白生物学活性的方法。

背景技术

Glycoprotein 130(gp130),分子量为130kD,又称为IL-6Rβ,是IL-6受体系统的重要组 成部分。sIL-6Rα与IL-6形成IL-6/sIL-6Rα复合物后,可以与膜型gp130分子结合,引起信 号传导,这称为反式信号传导通路,引起促炎症的效应。可溶性的gp130作为反式传导信号 的天然抑制剂,选择性地作用于IL-6/sIL-6Rα复合体,而不能与IL-6或sIL-6Rα单独结合。 将两个sgp130分子的二聚体与IgG1-Fc结合形成重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白(sgp130-Fc),可模拟天然反式信号传导抑制剂sgp130,且具有更高的结合亲和力,可抑制IL-6/sIL-6Rα复合物升高引起的异常炎症反应。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种原因不明的局限于结肠粘膜及粘膜下层、非 特异性炎性病变为主的肠道疾病,具有难愈、易复发、易癌变等特点,现已被WHO列为现 代疑难病症之一。IL-6是参与炎症性肠病病理生物学的中心细胞因子,UC患者的IL-6和 sIL-6Rα水平升高,反式信号传导增强。sgp130-Fc是一种用于治疗UC的首创、选择性IL-6 反式传导抑制剂和抗炎生物药,在关节炎、炎性肠病和结肠相关癌症等人类疾病的小鼠模型 中显示出非常好的治疗效果,其预期疗效与全效IL-6阻滞剂托珠单抗(tocilizumab,TCZ) 或抗肿瘤坏死因子(TNF)类药物类似,但安全性较忧,目前已进入II/III期临床。

活性测定是对药物的含量、有效成分和效价的测定,是确保药物有效性的重要质控指标。 目前重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白的生物学活性检测方法是BAF3/gp130细胞增殖抑制法, 原理为:sgp130-Fc融合蛋白可以抑制IL-6/sIL-6Rα复合物引起的BAF3/gp130细胞快速增殖。 但BAF3/gp130细胞对IL-6/sIL-6Rα只是部分依赖性增殖,如果培养太过密集,BAF3/gp130 细胞会丧失这种依赖性,只能维持在低密度培养,而且还要定期(4至6周)通过平行培养 不含IL-6/sIL-6Rα的细胞来监测对IL-6/sIL-6Rα的生长依赖性,一旦丧失了这种依赖性,便 不能够用于活性检测。这种细胞培养的不确定性也给活性检测带来了不稳定因素,容易引起 实验数据信噪比低,变异度大,重复性差。

发明内容

本发明的方法包括构建稳定表达SIE萤光素酶报告基因的细胞株,IL-6/sIL-6Rα复合物 可与细胞表面gp130结合,通过信号转导激活SIE反应元件,启动下游萤光素酶的表达; sgp130-Fc可竞争性结合IL-6/sIL-6Rα复合物,抑制萤光素酶的表达;加入萤光素酶底物后, 通过化学发光值拟合四参数曲线,从而测定sgp130-Fc融合蛋白的生物学活性。

本发明的目的在于提供一种快速测定sgp130-Fc融合蛋白生物学活性的方法,所述方法 包括:

(1)将含SIE反应元件的报告基因质粒转入细胞,加压筛选,获得稳定表达的单克隆细 胞株D23;

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