[发明专利]一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用

权利要求书

1.一种利用工程菌在制备大分子量透明质酸方面中的应用，所述工程菌含有用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒，所述用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒是将CovR基因或CovS基因与长度为221bp的Ppgk启动子插入pSET4s:: oriB.s载体的多克隆位点处，构建成功pSET4s:: oriB.s::CovR或pSET4s:: oriB.s::CovS；

其中，所述Ppgk启动子的序列为SEQ ID NO.3所示，所述基因表达载体pSET4s::oriB.s的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；

所述CovR基因的长度为687bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该CovR基因始于起始密码子 ATG 上游6bp，结束于终止密码子TAA；或者，所述CovS基因的长度为1363bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，该CovS基因始于起始密码子 TTG 上游15bp，结束于终止密码子TAG；

所述工程菌的构建方法为：

将用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒转入宿主菌，构建工程菌；其中，所述宿主菌为兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CovR基因、CovS基因来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus) ATCC 39920 基因组。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述转入为电转入。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为在以蔗糖为底物发酵生产透明质酸方面的应用。

5.一种利用工程菌制备大分子量透明质酸的方法，其特征在于：使用所述工程菌发酵获得；

所述工程菌含有用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒，所述用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒是将CovR基因或CovS基因与长度为221bp的Ppgk启动子插入pSET4s:: oriB.s载体的多克隆位点处，构建成功pSET4s:: oriB.s::CovR或pSET4s::oriB.s::CovS；

其中，所述Ppgk启动子的序列为SEQ ID NO.3所示，所述基因表达载体pSET4s::oriB.s的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；

所述CovR基因的长度为687bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该CovR基因始于起始密码子 ATG 上游6bp，结束于终止密码子TAA；或者，所述CovS基因的长度为1363bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，该CovS基因始于起始密码子 TTG 上游15bp，结束于终止密码子TAG；

所述工程菌的构建方法为：

将用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒转入宿主菌，构建工程菌；其中，所述宿主菌为兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920。

6.根据权利要求5所述的利用工程菌制备大分子量透明质酸的方法，其特征在于：步骤如下：

按接种量2%向发酵培养基中接入工程菌，37℃，pH7.0，转速200r/min，发酵24小时，即得大分子量透明质酸；

其中，所述的发酵培养基为：蔗糖：50g/L，酵母提取物：3. 5g/L，酪蛋白胨：l0g/L，NaCl：1.5g/L， K₂HP0₄：2g/L，MgSO₄ • 7H₂O ：0. 4g/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述CovR基因、CovS基因来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus) ATCC 39920 基因组；

所述转入为电转入。