[发明专利]一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用

说明书

本发明涉及一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒，所述遗传重组质粒是将CovR基因或CovS基因和长度为221bp的Ppgk启动子插入pSET4s::oriB.s载体的多克隆位点处，构建成功。本发明工程菌的HA产量明显高于野生型，以工程菌CovR/OP进行透明质酸的发酵生产，其透明质酸的产量比野生型菌株提高10％，透明质酸分子量比野生型提高10％；以工程菌CovS/OP进行透明质酸的发酵生产，其透明质酸的产量比野生型菌株提高20％，透明质酸分子量比野生型提高15％；本发明丰富了透明质酸的分子量类型，满足市场对不同分子量透明质酸的需求。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用。

背景技术

HA是一种天然的、由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺通过β-1-3和β-1-4糖苷键交替连接而成的一种高分子的规则线性的酸性粘多糖。由于HA是复杂的多种酸性粘多糖的混合物，因而它的分子量并不是一个固定的值，且不同分子量的HA具有不同的功能。大分子量HA主要用于医药领域，小分子量HA主要用于化妆品中；为了满足不同的市场需求，越来越多的研究集中于怎样改变HA的分子量，以期获得更多不同分子量的HA。目前，不同分子量的透明质酸制备方法主要通过物理方法、化学方法和酶法。三种方法分别具有需要条件剧烈、环境污染严重、不适合规模化生产的缺点。利用发酵工程手段直接发酵生产不同分子量的HA可以避免上述缺点，成为当前的一个研究热点。目前生产用菌株的主要缺陷之一是生产的透明质酸分子量偏低，针对这一问题，研究人员通过不同策略获得了不同类型的大分子量透明质酸工程菌株，比如，野生型菌株通过敲除hylB基因获得突变株ΔhylB，可稳定生产平均分子量为3.9MDa的透明质酸(CN201310737032.5)；也有报道通过高表达hasD，获得的重组菌株产生的透明质酸分子量可达5.4MDa(Journal of Biological Chemistry,284(27),18007–18014.)。但是，目前大分子量透明质酸工程菌所对应的分子量类型较少，不能满足市场对不同分子量透明质酸的需求。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中市场对大分子量透明质酸的巨大需求，而现有工程菌所生产的HA分子量类型少、范围窄的问题，提供一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用，丰富了透明质酸的分子量类型，满足市场对不同分子量透明质酸的需求。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒，所述遗传重组质粒是将CovR基因或CovS基因与长度为221bp的Ppgk启动子插入pSET4s::oriB.s载体的多克隆位点处，构建成功pSET4s::oriB.s::CovR或pSET4s::oriB.s::CovS；

其中，所述Ppgk启动子的序列为SEQ ID NO.3所示，所述基因表达载体pSET4s::oriB.s的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

而且，所述CovR基因的长度为687bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该CovR基因始于起始密码子ATG上游6bp，结束于终止密码子TAA；或者，所述CovS基因的长度为1363bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，该CovS基因始于起始密码子TTG上游15bp，结束于终止密码子TAG。

而且，所述CovR基因、CovS基因来源于兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC 39920基因组。

一种含有如上所述的用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒的工程菌。

而且，所述工程菌的构建方法为：