[发明专利]促进牛体外胚胎培养受精卵发育的方法

权利要求书

1.一种胚胎培养液，其是包含：109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、2.5v/v％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺1mM、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸、3mM的谷胱甘肽、枸橼酸钠0.04w/v％、麦芽糖0.02w/v％的水溶液；所述必需氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-盐酸精氨酸6.32g、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g、L-盐酸组氨酸一水物2.1g、L-异亮氨酸2.625g、L-亮氨酸2.62g、L-赖氨酸盐酸盐3.625g、L-蛋氨酸0.755g、L-苯丙氨酸1.65g、L-苏氨酸2.38g、L-色氨酸0.51g、L-酪氨酸1.8g和L-缬氨酸2.34g，所述非必须氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-丙氨酸0.89g、L-天门冬酰胺一水物1.5g、L-天冬氨酸1.33g、L-谷氨酸1.47g、甘氨酸0.75g、L-脯氨酸1.15g和L-丝氨酸1.05g。

2.根据权利要求的胚胎培养液，其是包含：109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、2.5v/v％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺1mM、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸、3mM的谷胱甘肽、枸橼酸钠0.04w/v％、麦芽糖0.02w/v％、0.002～0.005w/v％(例如0.003w/v％)β-胡萝卜素、0.01～0.02w/v％(例如0.015w/v％)抗坏血酸的水溶液；所述必需氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-盐酸精氨酸6.32g、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g、L-盐酸组氨酸一水物2.1g、L-异亮氨酸2.625g、L-亮氨酸2.62g、L-赖氨酸盐酸盐3.625g、L-蛋氨酸0.755g、L-苯丙氨酸1.65g、L-苏氨酸2.38g、L-色氨酸0.51g、L-酪氨酸1.8g和L-缬氨酸2.34g，所述非必须氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-丙氨酸0.89g、L-天门冬酰胺一水物1.5g、L-天冬氨酸1.33g、L-谷氨酸1.47g、甘氨酸0.75g、L-脯氨酸1.15g和L-丝氨酸1.05g。

3.牛体外受精胚胎培养的方法，其包括如下步骤：

(1)卵母细胞的采集和体外成熟

离体采集：取屠宰场卵巢盛放于加双抗生理盐水的保温桶中，30.5-33℃条件下，4h内运回实验室；抽取表面2-8mm的卵泡，收集沉淀，在体视显微镜下捡出至少含有3层卵丘细胞包裹的卵母细胞COCs即卵丘-卵母细胞复合体，在洗卵液中洗涤2遍，去除多余杂质；

活体采集：对牛进行活体采卵，将所得卵泡液在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体，放入包含HEPES的成熟培养液中38.8℃、3h内运回实验室；

将以上离体采集或者活体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22-24h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5％CO2、饱和湿度；

(2)体外受精

将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；

从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300μL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；

将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5％CO2、饱和湿度；

(3)胚胎体外培养及保存

体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6％O2、88％N2、饱和湿度，第3天记录卵裂率和8-16细胞率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率，并进行质量鉴定；

将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存。