[发明专利]一种DNA测序反应试剂及其制备方法

权利要求书

1.一种DNA测序反应试剂，其特征在于，该试剂由BigDye v3.1、5X Buffer与辅酶制备而成；

其中所述BigDye v3.1、辅酶与5X Buffer的体积比为1～1.2∶1～1.1∶7～8.2，将BigDye v3.1、辅酶与5X Buffer按照配比混合均匀后，得到DNA测序反应试剂；

所述BigDye v3.1为Thermo公司生产；

所述辅酶选用0.5-1U Taq(F667Y)DNA聚合酶。

2.根据权利要求1所述的一种DNA测序反应试剂，其特征在于，所述辅酶的浓度大于等于95％。

3.根据权利要求1所述的一种DNA测序反应试剂，其特征在于，所述辅酶的酶活性大于等于5U/ul。

4.根据权利要求1所述的一种DNA测序反应试剂，其特征在于，所述DNA测序反应试剂由体积比为1∶1∶7的BigDye v3.1、辅酶与5X Buffer配制而成。

5.根据权利要求1所述的一种DNA测序反应试剂，其特征在于，所述辅酶的制备包括如下步骤：

S1、基因合成相应的目标序列及装载到相应的目的载体，将得到质粒转化到相应的表达菌株；

S2、挑取单克隆进行表达筛选；

S3、对筛选得到的菌株进行放大表达；

S4、表达后得到的菌株蛋白进行蛋白纯化；

S5、目的蛋白过分子筛进行再次纯化；

S6、蛋白检测浓度纯度；

S7、蛋白活性检测。

6.根据权利要求5所述的一种DNA测序反应试剂，其特征在于，所述步骤S3中通过IPTG诱导对筛选得到的菌株进行放大表达。

7.根据权利要求5所述的一种DNA测序反应试剂，其特征在于，所述步骤S4中通过Ni亲和层析柱法对菌株表达蛋白进行纯化。

8.根据权利要求1所述的一种DNA测序反应试剂，其特征在于，利用该测序反应试剂进行DNA测序的步骤为：

SS1、使用pet载体抽提质粒F44426；

SS2、从储藏室中取出96孔板，解冻4-7秒，然后将96孔板以1500rpm离心2秒，将质粒模板放在96孔板中；

SS3、将测序反应剂稀释16倍，在96孔板的孔中添加稀释后的测序反应剂1ul；

SS4、对质粒样品进行测序的PCR反应：96℃预变性3分钟后冰水淬火；

以96℃处理10秒、50℃处理5秒、60℃处理150秒为一个循环，进行32个循环后在4℃温度下保存；

SS5、对PCR产物进行纯化并上机测序。

9.根据权利要求5所述的一种DNA测序反应试剂，其特征在于，步骤S5中目的蛋白过分子筛进行再次纯化的方法为：

向经过Ni亲和层析柱法初步纯化后得到的表达蛋白中加入β-丙内酯对病原微生物进行灭活，之后进行分子筛层析，使用超纯水洗脱收集目的蛋白；

使用孔径为30K的膜包进行超滤浓缩，使目标蛋白的浓度不小于5mg/mL，最后使用0.2微米的滤膜过滤除菌得到再次纯化的目标蛋白。

10.根据权利要求9所述的一种DNA测序反应试剂，其特征在于，所述分子筛由50-60重量份葡萄糖凝胶、5-8重量份纳米沸石、8-12重量份凹凸棒土与3-4重量份聚乙烯醇制备而成，其中葡萄糖凝胶为G-25与G-50中的一种，该分子筛的制备方法为：

将凹凸棒土在300℃温度下焙烧1-2h进行脱水，再通过硅烷偶联剂对凹凸棒土进行表面处理，处理后通过超纯水洗涤并干燥，得到改性凹凸棒土；

通过纳米沸石均匀修饰改性凹凸棒土，得到芯料；

将芯料与聚乙烯醇均匀混合后，向其中加入聚乙烯醇混合后加超纯水并进行水浴加热，水浴温度为95-98℃，搅拌至聚乙烯醇完全溶解后降温至35-50℃得到修饰液待用；

将葡萄糖凝胶浸入0.02mol/L的磷酸缓冲液中进行溶胀，其中磷酸缓冲液的pH为6.2-6.8，溶胀结束后采用超纯水冲洗，并将冲洗后的葡萄糖凝胶加入修饰液中，以转速60-90r/min搅拌15-25min后得到装柱凝胶；

将装柱凝胶在真空干燥器中脱气20-30min后，进行装柱，得到分子筛。