[发明专利]一种DNA测序反应试剂及其制备方法

说明书

本发明公开一种DNA测序反应试剂及其制备方法，该试剂由BigDye v3.1、5X Buffer与辅酶制备而成，其中所述BigDye v3.1、辅酶与5X Buffer的体积比为1～1.2∶1～1.1∶7～8.2；本发明通过在测序反应中添加的试剂中加入辅酶并调整添加的试剂配比，在Sanger测序反应中通过该DNA测序反应实际，可应用于对常见的特殊DNA结构，例如发夹结构、高GC含量序列或重复序列等的测序中，可有效避免在测序过程中出现测序信号提前中断、信号减弱较快导致测序有效序列短、序列不准确等问题，从而能提供正对于复杂结构DNA的可靠、精准的测序结果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种DNA测序反应试剂及其制备方法。

背景技术

目前DNA测序主要有两种方法：Maxam和Gilbert的化学法以及Sanger的双脱氧核苷酸终止法，其中Sanger法通过使用链终止剂-类似于正常dNTP的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸，将延伸的DNA链特异性地终止，其反应在测序过程中会经常应用到一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，即测序酶(sequenase)。

天然聚合酶的许多特性不适合DNA测序，测序酶应该具备的特性包括：(1)较高的持续合成能力：持续合成能力是指酶从引物-模板退火复合物上脱离之前链持续延伸的程度；(2)耐热性：在高温条件下抵抗失活或分解的能力是酶在现代高技术投入循环测序反应中的最重要的因素；(3)核苷酸类似物嵌入染色末端：嵌入类似物的能力对双脱氧链终止法起决定性因素；带每个标记染料末端的终止的效率必须与避免低质量的不均匀峰数据的效率相似。

自动测序的发展催生了对更好的测序酶的追求，但目前应用于测序反应的酶效率不高，需要提高聚合酶的效率，缺失型Taq酶去除了5′-3’外切酶活性，续进性只有2个碱基左右，DNA聚合酶的续进性(Processivity)，即每次聚合酶结合引物-模板复合体后催化合成的寡核苷酸的数量，这一性能可通过增强酶-核酸复合体的稳定来实现增强，另外，测序酶过早地脱离模板会导致通过测序反应无法得到可靠的序列信息。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA测序反应试剂及其制备方法。

本发明需要解决的技术问题为：

目前应用于测序反应的酶效率不高，需要提高聚合酶的效率，导致在测序过程中容易出现测序信号提前中断、信号减弱较快导致测序有效序列短、序列不准确等问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种DNA测序反应试剂，该试剂由BigDye v3.1、5X Buffer与辅酶制备而成；

其中所述BigDye v3.1、辅酶与5X Buffer的体积比为1～1.2∶1～1.1∶7～8.2，将BigDye v3.1、辅酶与5X Buffer按照配比混合均匀后，得到DNA测序反应试剂；

所述BigDye v3.1为Thermo公司生产产品；

所述辅酶选用0.5-1U Taq(F667Y)DNA聚合酶；

所述辅酶的浓度大于等于95％；

所述辅酶的酶活性大于等于5U/ul；

所述辅酶的制备包括如下步骤：

S1、基因合成相应的目标序列及装载到相应的目的载体，将得到质粒转化到相应的表达菌株；

S2、挑取单克隆进行表达筛选；

S3、通过IPTG诱导对筛选得到的菌株进行放大表达；

S4、通过Ni亲和层析柱法对表达后得到的菌株蛋白进行蛋白纯化；

S5、目的蛋白过分子筛进行再次纯化；