[发明专利]盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法有效
申请号: | 201910425496.X | 申请日: | 2019-05-21 |
公开(公告)号: | CN110157776B | 公开(公告)日: | 2022-10-25 |
发明(设计)人: | 徐宗昌;任婷婷;李义强;张成省;杜海娜;孟晨;马斯琦;王萌 | 申请(专利权)人: | 中国农业科学院烟草研究所 |
主分类号: | C12Q1/6806 | 分类号: | C12Q1/6806 |
代理公司: | 北京科家知识产权代理事务所(普通合伙) 11427 | 代理人: | 陈娟 |
地址: | 266101 山东*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 胁迫 下碱蓬 稳定 表达 内参 基因 筛选 方法 | ||
1.盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)初步筛选14个稳定的候选内参基因,其基因名分别为:ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、UBC28、EF1α、PP2A、DREB1D、TIM、V-H+-ATPase、MPK6、PHT4;5、CESA1;针对候选基因,设计相应扩增引物;
2)提取不同盐浓度处理的碱蓬总RNA,并测定其浓度,获得的不同盐浓度处理碱蓬总RNA反转录成cDNA,并以上述获得的所有样品cDNA等核酸量混合后的总cDNA和碱蓬gDNA做为扩增模板,并利用PCR检测引物的特异性;
3)以不同盐浓度处理的碱蓬cDNA为模板,对11个候选内参基因在qRT-PCR仪器上进行反应,上述11个候选内参基因名分别为:ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V-H+-ATPase、MPK6、PHT4;5、CESA1;测量方法为荧光定量PCR反应法;
4)利用荧光定量PCR反应后得到的Ct值,对各候选内参基因进行稳定性分析;
5)通过geNorm确定准确定量的最优内参基因数目,以0.15为阈值,通过标准化因子配对差异分析Vn/n+1值来判定内参基因的最合适数目;
6)对碱蓬CESA基因表达量变化进行计算,以10个基因做为内参基因,对目的基因CESA在不同盐浓度处理条件下表达量的变化进行计算,上述10个内参基因为ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V-H+-ATPase、MPK6、PHT4;5。
2.根据权利要求1所述的盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法,其特征在于,所述步骤4)中采用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder软件对各候选内参基因进行稳定性分析,并确定内参基因的Ct值,在15-25之间。
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