[发明专利]盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法

说明书

本发明公开了盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法，根据实验室获得的转录组分析结果及其他植物已报道的内参基因序列信息，初步筛选表达相对较为稳定的14个候选内参基因，其基因名分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、UBC28、EF1α、PP2A、DREB1D、TIM、V‑H⁺‑ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；针对上述候选基因，设计相应扩增引物，并进行内参基因的筛选，本发明筛选了10个在碱蓬基因表达谱中稳定表达的基因，以其作为碱蓬盐胁迫内参基因，有利于提高碱蓬盐胁迫条件下基因表达分析研究的稳定性和可靠性；本方法弥补了现有的单一内参基因可能导致实验结果有偏差甚至错误的不足，能够得到更为可靠的结论，对于推动分子生物学方法的改进和完善、揭示细胞分化、发育、形态发生具有重要意义。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法及应用。

背景技术

碱蓬属(Suaeda)植物属于重要的盐生植物资源，全球约100余种，主要生长于海滨、湖边和荒漠等处的盐碱荒地，是一种典型的盐碱地指示植物。我国有碱蓬属植物20种及1个变种，分布广泛。目前，人们对碱蓬属植物的研究主要集中在其栽培与组织培养、耐盐基因开发与利用以及离子运输与信号传导等方面。也有学者研究了碱蓬属植物在水培条件下对重金属元素的吸收效应，以及碱蓬属植物对有盐度富营养化水体的生物修复效应。碱蓬可作为模式生物用于植物耐盐、抗逆机制的研究，还可作为修复植物用于受污染滨海湿地的生态恢复。因此碱蓬属植物所含有的丰富抗逆性基因资源亟待开发。

实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitative reversetranscription-polymerase chain reaction，FQ RT-PCR)由于其灵敏性高及特异性好被广泛应用于基因表达研究，它能检测极低含量的mRNA以及基因在不同样品间细微的表达差异变化，因此qRT-PCR常用来筛选有研究价值的关键基因。而其结果的准确性在很大程度上取决于内参基因的稳定性。为了去除不同样本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。理想的内参基因应该在不同的基因型、不同发育阶段、不同组织器官和不同胁迫条件下恒定表达，但事实上这样的理想内参基因根本不会存在。广泛的实验数据表明内参基因可能受不同组织、不同发育阶段或不同环境胁迫等条件的影响而稳定性发生变化，所以单一内参可能导致有偏差不准确甚至错误的实验结果。因此，需要根据不同物种及不同试验条件筛选合适的内参基因，这对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法，包括以下步骤：

1)初步筛选14个稳定的候选内参基因，其基因名分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、UBC28、EF1α、PP2A、DREB1D、TIM、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；针对上述候选基因，设计相应扩增引物；

2)提取不同盐浓度处理的碱蓬总RNA，并测定其浓度，获得的不同盐浓度处理碱蓬总RNA反转成cDNA，并以上述获得的所有样品cDNA等核酸量混合后的总cDNA和碱蓬gDNA作为扩增模板，并利用PCR检测引物的特异性；

3)以不同盐浓度处理的碱蓬cDNA为模板，对11个候选内参基因在qRT-PCR仪器上进行反应，上述11个候选内参基因命分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V-H⁺-ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；测量方法为荧光定量PCR反应法；

4)利用荧光定量PCR反应后得到的Ct值，对各候选内参基因进行稳定性分析；