[发明专利]一种高效简便纯化蛋白的方法

权利要求书

1.一种蛋白纯化标签CipA-GGGGSGGGGSGGGGS-DnaB，其特征在于将自组装蛋白CipA，柔性连接肽GGGGSGGGGSGGGGS和内含肽蛋白DnaB顺序融合，其中CipA的氨基酸序列如序列1所示，DnaB的氨基酸序列如序列2所示。

2.一种高效简便纯化蛋白的方法，其质粒构建及蛋白纯化方法如下：

(1)构建质粒pET-28a-cipA-GGGGSGGGGSGGGGS-dnaB-eGFP，采用OE-PCR法合成了基因cipA、GGGGSGGGGSGGGGS、dnaB和eGFP，其中CipA的氨基酸序列如序列1所示，DnaB的氨基酸序列如序列2所示，通过OE-PCR分别将cipA和eGFP连接到dnaB的5’端和3’端，随后将GGGGSGGGGSGGGGS插入到cipA和dnaB之间，通过Gibson组装将cipA-GGGGSGGGGSGGGGS-dnaB-eGFP克隆到pET-28a载体上，随后，将PCR产物转化至大肠杆菌XL10-Gold，并通过DNA测序验证质粒；

(2)表达蛋白CipA-GGGGSGGGGSGGGGS-DnaB-eGFP，将质粒pET-28a-cipA-GGGGSGGGGSGGGGS-dnaB-eGFP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落接种于5mL LB培养基中，加入50μg/mL卡那霉素，37℃过夜培养获得种子液，次日，将种子液接种于200mL新鲜TB培养基中，37℃培养2h，使OD₆₀₀达到0.5-0.8，在培养液中加入0.5mM异丙基-B-D-硫半乳糖苷，30℃培养10h，为防止代谢产物使培养基pH下降，在0h、2h、4h和6h分别向培养液中加入25mM，pH8.5，HEPES；

(3)获得重组蛋白，将(2)中表达完蛋白的发酵液，4000×g，4℃，离心20min，弃上清，获得菌体，加入50mL，50mM，pH7.5，Tris-HCl缓冲液重悬，超声破碎后，4000×g，4℃，离心20min，弃上清，最终获得CipA-GGGGSGGGGSGGGGS-DnaB-eGFP包涵体；

(4)通过DnaB裂解纯化eGFP，用50mL，50mM，pH6.5，Tris-HCl缓冲液洗涤CipA-GGGGSGGGGSGGGGS-DnaB-eGFP包涵体两次后重悬，23℃放置18h，使内含肽自裂解，将裂解混合物10000×g，4℃，离心20min，其中CipA-GGGGSGGGGSGGGGS-DnaB为沉淀，eGFP为上清液中的纯蛋白，通过SDS-PAGE验证eGFP的含量和纯度。