[发明专利]一种高效简便纯化蛋白的方法

说明书

传统的柱层析纯化重组蛋白的工艺生产成本较高，步骤繁琐。基于亲和标签的非色谱纯化方法可降低成本，提高靶蛋白产量，但标签去除成本较高。为解决上述问题，本发明提出了一种仅需离心和裂解步骤的简便、高效的纯化方法。该方法使用了CipA包涵体蛋白和内含肽蛋白(Synechocystis sp.PCC6803 DnaB，Ssp DnaB)，利用CipA的自组装功能和DnaB的在弱酸条件下的自裂解功能来实现蛋白纯化。其中靶蛋白可以是要表达和纯化的任意一种蛋白，且纯化后纯度可达95％以上。此外，本发明还对CipA和DnaB之间的连接肽进行了优化，进一步提高了DnaB的裂解效率，同时降低了CipA对靶蛋白活性的影响。该方法有潜力应用于酶的工业化生产。关键词：蛋白质纯化方法，包涵体蛋白CipA，自断裂蛋白DnaB。

技术领域

本发明涉及一种表达包涵体蛋白CipA，一种自裂解的内含肽和目标蛋白eGFP的质粒pET-28a-cipA-dnaB-eGFP。本发明还涉及该质粒的构建方法及目标蛋白的纯化方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

随着分子生物学、细胞工程和发酵工程的发展，重组蛋白的表达效率显著提高。尽管取得了这样的成功，开发一种大规模、简便且高效的蛋白纯化方法仍然是一项巨大的挑战。在酶催化过程中，酶纯度是降低生产所需产物成本的一个必要环节。许多研究提到使用不同的方法纯化靶蛋白，例如亲和纯化^[1,2]，使用自聚集纯化标签^[3-5]和自我裂解标签(内含肽)^[6,7]等。在这些方法中，亲和纯化在纯化过程中占主导地位，并以其操作简单和纯化效率高仍作为蛋白质纯化的首选。常用的亲和标签包括MBP，His和GST^[8,9]。但亲和纯化具有许多缺点。例如，亲和标签会降低目标酶的催化效率^[9]。另外，亲和标签的切除操作复杂且造价高。尽管相应的亲和树脂可以通过公司购买,并且能达到很高的纯度，但在利用这些方法处理大量的样品时,不得不考虑其高昂的树脂成本和缓慢的纯化速度。

多年来，生物聚合物已被应用于开发低成本且高效的非色谱纯化方法，经实践证实其具有良好的选择性和较高的产率。在大多数情况下，利用生物聚合物作为纯化标签，可以诱导被标记的融合蛋白在特定的化学或物理条件下形成具有高度选择性的聚集体。报道的标签包括弹性蛋白样多肽(ELP)、毒素重复(RTX)结构域和ELK16^[10-13]。其中尤其是ELP标签，它可诱导蛋白聚集。与其他纯化标签一样，这些标签在纯化过程中有时需要被除去，对于可能影响靶蛋白性质的大标签来说，这一步骤尤其重要。常用的标签去除方法包括使用蛋白酶如Xa因子、TEV蛋白酶和鼻病毒3C蛋白酶^[14–16]，但蛋白酶需要额外的纯化步骤来去除，这些纯化步骤会对靶蛋白造成一定的损害，如解离反应可能导致靶蛋白的非特异性裂解或在靶蛋白上留下少量的“残基”氨基酸。使用大量酶去除蛋白标记所带来的高成本严重地限制了它们的应用。据报道，具有自我剪切功能的内含肽已被用于标签去除。内含肽可通过编码基因插入到标记的靶蛋白序列中，其位点特异性自我切割的功能可实现将标签从靶蛋白质上去除的效果。因此，与蛋白酶相比，内含肽在时间成本和生产成本方面具有更高的效益。

为了简化蛋白质纯化操作步骤并降低亲和标签对靶蛋白的影响，本发明提出了一种由CipA蛋白和内含肽介导的纯化方法。CipA是一种含有104个氨基酸的小蛋白质，存在于发光杆菌Photorhabdus luminescens(P.luminescens)中，可以在菌体中自发组装成包涵体(PCIs)。此外，将目标蛋白融合在CipA的C端，融合的蛋白仍可保持其活性。本发明将CipA与靶蛋白P融合，为了从重组蛋白中除去CipA并获得没有任何标签的靶蛋白，在CipA和靶蛋白P之间插入了小内含肽(Synechocystis sp.PCC6803DnaB,Ssp DnaB)以产生CipA-DnaB-PPCIs。DnaB可以在低pH条件下通过其C端裂解与融合的靶蛋白分离。此外，为了提高DnaB自裂解的效率并在上清液中获得更多的靶蛋白，本发明在CipA和DnaB之间插入不同的连接肽。本发明提出了一种新颖简单的蛋白质纯化方法，可以降低所需蛋白质的工业化生产成本。