[发明专利]一种采用二氧化锰修饰的上转换纳米材料检测碱性磷酸酶的方法

权利要求书

1.一种采用二氧化锰修饰的上转换纳米材料检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）0.1 mol/L，25 ℃Tris-HCl缓冲液的配制：

称取1.576 g，Mw=157.6Tris-HCl，溶于100 mL高纯水中；用0.5 mol/L氢氧化钠调节溶液的pH=7.4，用高纯水定容在100 mL容量瓶中，低温保存；

（2）2-磷酸-L-抗坏血酸AAP溶液的配制：

称取0.2577 g AAP，溶于8 mL高纯水中，并稀释至4 mM的溶液；

（3）碱性磷酸酶溶液的配制：

将碱性磷酸酶用碱性磷酸酶缓冲液分别稀释至不同浓度，配制成250 U/L、100 U/L、50U/L、25 U/L、10 U/L、5 U/L、1 U/L、0.5 U/L、0.1 U/L的溶液；

（4）二氧化锰修饰的上转换纳米粒子对碱性磷酸酶的检测：

①用移液枪取500 µL2-磷酸-L-抗坏血酸(AAP)溶液和500 µL不同浓度碱性磷酸酶溶液，混合均匀后在37℃中反应15 min-120 min；

②取2 mL二氧化锰修饰的上转换溶液,加入600 µL高纯水，再加入400 µLTris-HCl，pH=7.4缓冲溶液，加入1 mL2-磷酸-L-抗坏血酸(AAP)和不同浓度碱性磷酸酶反应产物，混合均匀，反应10-60 min，用荧光分光光度计检测荧光强度变化值；

1、镱和铥掺杂四氟钇钠NaYF₄:Yb, Tm 上转换纳米粒子由水热法合成，聚乙烯亚胺作为包覆剂，Y, Yb, Tm的摩尔比为75: 25: 0.3，按如下步骤进行：

（1）前处理硝化：分别称取Y₂O₃, Yb₂O₃, Tm₂O₃三种稀土氧化物，其摩尔比为75: 25:0.3，加入到烧杯A中，再依次加入2 mL浓硝酸和2 mL高纯水，将小烧杯放入电热套中加热，待氧化物硝化完全变成硝酸盐后继续加入5 mL高纯水，待即将蒸干时继续加入5 mL高纯水，测此时溶液的pH值，如此重复加入高纯水至溶液pH值约为7后，蒸干后加入5 mL高纯水备用；

（2）合成：称取氢氧化钠和氟化铵各10 mmol加入到烧杯B中，继续称取0.15g不同分子量的聚乙烯亚胺,Mw=10000, Mw=1800, Mw=600加入到烧杯A中，随后A烧杯中加入4.5 mL乙二醇3 mL高纯水，向B烧杯中加入4.5 mL高纯水3 mL乙二醇；

分别将A、B两个烧杯超声5-10分钟，再磁力搅拌5-10分钟，超声搅拌交替进行至烧杯中的物质溶解约50-60分钟，将A烧杯中含稀土离子和聚乙烯亚胺（PEI）的透明溶液转移至B烧杯中，转移完全后停止搅拌，静置，转移到聚四氟乙烯的反应釜中，加热至200 ℃，反应12 h后，冷却至室温；

（3）洗涤：将反应后的溶液用玻璃棒搅拌均匀后，用乙醇和反应溶液以体积比3:1洗涤，离心弃去上清液，洗涤三次后，再用高纯水洗涤离心三次后，将得到的上转换纳米粒子放到真空干燥烘箱中干燥12 h；

2、二氧化锰修饰的上转换纳米粒子合成：

（1）0.1 mol/L，25℃ MES缓冲液的配制：

称取2.012 g2-（N-吗啉代）乙磺酸,溶于100 mL水中，用0.5 mol/L氢氧化钠调节溶液的pH=6，用高纯水定容在100 mL容量瓶中，低温保存；

（2）KMnO₄溶液的配制：

取8 mM的KMnO₄溶液，分别稀释至不同浓度，配制成4 mM、3 mM、2 mM、1 mM、500 μΜ、400μΜ、300 μΜ、200 μΜ、100 μΜ的溶液；

（3）上转换溶液的配制：

称取0.0200 g干燥得到的上转换纳米材料，溶于8 mL高纯水中超声混匀；

（4）取500 μL上转换溶液，250 μL MES溶液，250 μL不同浓度的KMnO₄溶液于1.5 mL离心管中，混匀后超声15-30 min,得到的溶液离心弃去上清液，再加1 mL高纯水离心洗涤，重复三次后，将所得溶液加水稀释至4 mL。

2.权利要求1所述的二氧化锰修饰的上转换纳米材料检测碱性磷酸酶的方法，其中所述的碱性磷酸酶样品必须溶于碱性磷酸酶缓冲液中，碱性磷酸酶缓冲液配方为：0.1MTris-HCl、0.1 M氯化钠、2 mM氯化镁，经高压灭菌处理。