[发明专利]一种采用二氧化锰修饰的上转换纳米材料检测碱性磷酸酶的方法

说明书

本发明公开了一种用二氧化锰修饰的上转换纳米粒子检测碱性磷酸酶的方法。镱和铥掺杂四氟钇钠(NaYF₄:Yb,Tm)上转换纳米粒子粒径在2 nm左右，其发射光谱在471 nm处。镱和铥掺杂四氟钇钠(NaYF₄:Yb,Tm)上转换纳米粒子和二氧化锰修饰的上转换纳米粒子的合成方法简单，检测碱性磷酸酶操作简便，无需昂贵的仪器，快速灵敏，在生物样品检测中能避免自体荧光的干扰，而且毒性小。本方法对碱性磷酸酶的线性范围为0.1 U/L‑100 U/L，检出限为0.41 U/L，在实际生物样品分析检测和生物成像中有优良的应用前景。

本申请 得到国家自然科学基金面上项目(21375095)，天津市自然科学基金青年项目(No.17JCQNJC05800)的支持。

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，涉及一种片层状无定形二氧化锰修饰的上转换纳米材料对癌症标记物碱性磷酸酶的检测应用。

背景技术

上转换纳米材料通常可以将两个或者更多的低能量的光子转换为高能量的光子发射，由于上转换材料的发光是吸收波长长的低能量光（通常为980 nm近红外光）发射出波长短的高能量光，因而又被称为反斯托克斯发光。稀土掺杂的上转换的发生过程主要依赖于稀土离子的阶梯状能级，稀土离子内层4f电子几乎不与基质发生相互作用，因此掺杂的稀土离子的吸收和发射光谱与其自由离子相似，显示出极尖锐的峰，同时反斯托克斯位移大，无自体荧光的干扰，毒性低且组织穿透深度达，表现出优良的光学性质，因而上转换纳米材料在生物传感和成像受到研究者的广泛关注。

碱性磷酸酶，是一组同工酶，广泛存在于人体骨骼、肝脏、肠和肾，可以去除生物小分子，蛋白质和核酸上携带有游离羟基的磷酸基团，该过程被称为“去磷酸化，在细胞内蛋白质活性的生物转导和调控中起着重要的作用。人体内正常的碱性磷酸酶水平范围是46-190 U/L。碱性磷酸酶水平值异常与人体多种疾病（骨骼疾病如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移，肝胆疾病如肝外胆道阻塞、肝癌、肝硬化、毛细胆管性肝炎）相关，并且对于癌症的早期诊断和筛查具有重大意义。传统检测碱性磷酸酶的方法有同位素标记法，质谱法，电化学法，比色法和表面增强共振拉曼散射等。这些方法存在仪器消耗大，检测速度慢，成本高和样品处理过程复杂等缺点。而荧光法由于其快速，简单和成本低的优点受到科研人员的关注。本发明利用二氧化锰修饰的上转换纳米材料的独特光学性质和碱性磷酸酶与2-磷酸-L-抗坏血酸的水解作用，通过荧光的线性变化值实现对碱性磷酸酶的快速灵敏检测。

目前已报道的检测癌症标记物的方法主要有比色法，荧光法,色谱法和电化学法，这些方法存在选择性差，灵敏度低，耗时长，成本高，生物相容性差以及在实际样品检测中无法避免自体荧光的干扰等缺点，因此发展一种操作简单、反应迅速、灵敏度高的二氧化锰修饰的上转换纳米材料检测碱性磷酸酶的方法十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、反应迅速、灵敏度高的二氧化锰修饰的上转换纳米材料检测癌症标记物的方法。

为实现上述目的，本发明公开了一种采用二氧化锰修饰的上转换纳米材料检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）0.1 mol/L，25℃Tris-HCl缓冲液的配制：

称取1.576 g（Mw=157.6）Tris-HCl，溶于100 mL高纯水中；用(0.5 mol/L)氢氧化钠调节溶液的pH=7.4，用高纯水定容在100 mL容量瓶中，低温保存；

（2）2-磷酸-L-抗坏血酸(AAP)溶液的配制：

称取0.2577 g AAP，溶于8 mL 高纯水中，并稀释至4 mM的溶液；

（3）碱性磷酸酶溶液的配制：